复发缓解型多发性硬化患者外周血miR-132、miR-146a与认知障碍的关系①

谢 阳 刘梦兰 罗思维 孟仁亮 吕志宇 （西南医科大学附属医院神经内科，泸州646000）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system，CNS）白质的慢性炎性脱髓鞘为主要病变特点的疾病，MS的发病率在20~40 岁时最高，是致残中青年人的主要疾病之一［1］。MS 患者临床的症状多样，除较为常见的运动障碍、视觉异常及自主神经功能障碍以外，认知功能障碍也是常见的症状之一［2］。对MS 的临床样本和社区研究中发现，约60%的患者存在不同程度的认知功能障碍，表现为瞬时记忆及长期记忆力的下降，执行能力、视觉空间能力、注意力和处理信息速度等认知能力的下降［3］。而临床MS 患者仍以轻度认知障碍（cognitive impairment，CI）较为常见。而miRNA 作为真核生物的一类内源性非编码RNA，能够对mRNA 的表达进行转录后水平的调控，并且研究发现其在细胞生长、分化增殖及凋亡中发挥关键作用，参与一系列生命进程，并在多种自身免疫性疾病的进展中发现其可以对免疫系统发挥调节功能，作为自身免疫性疾病之一的MS，也被证实存在异常的 miRNA 表达，其中 miR-146a 及 miR-132 被发现在 MS 高峰期时异常表达［4-5］，同时 miRNA 被证实在不同疾病引起的认知功能障碍中起关键调控作用，然而在RRMS 中导致认知功能障碍的作用尚不清楚。本研究通过对RRMS 患者血清miR-132 及miR-146a 的水平测定，分析其与认知功能障碍MMSE 评分的相关性和独立危险因素分析，探究RRMS患者认知功能障碍严重程度与miR-132、miR-146a的关系，为临床的诊治提供理论证据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本研究通过西南医科大学附属医院伦理委员会批准，所有研究对象及家属均签署知情同意书。纳入西南医科大学附属医院神经内科2018年6月至2020年5月期间收治的RRMS患者80 例，其中男 26 例，女 54 例，年龄 20~49 岁，平均（32.19±5.07）岁。入组标准：①符合MS 诊断与治疗的中国专家共识［6］；②分型为复发缓解型，并正处于急性发作期；③完善头颅及脊髓MRI 检查；④患者均知情同意并签署知情同意书；⑤意识清楚，能配合完成研究者；排除标准：①有严重的心肝肾等器质性疾病；②合并有恶性肿瘤、严重感染及意识障碍不能配合研究者；③本次患病以前已经出现认知功能障碍者；④其他可能引起认知功能障碍或意识障碍的神经系统疾病；⑤合并其他自身免疫性疾病者；⑥有长期精神活性药物依赖或大量饮酒史。

1.1.2 主要试剂与仪器 M-MLV 逆转录试剂盒（TIANGEN，中国）；miRNA 荧光检测试剂盒（QIA‐GEN，德国）。

1.2 方法

1.2.1 分组及认知功能测定 所有纳入的患者在入院首日采用简明精神状态量表（mini-mental state examination，MMSE）对认知功能进行评估。其中MMSE 最高为30分，最低为0分，分值越低代表认知功能障碍越严重。按国际化标准：以26 分为界限，21~26 分者为轻度 CI，10~20 分者为中度 CI；<10 分者为重度CI。依据MMSE 量表结果将所有纳入的RRMS患者分为2组，分别为有认知障碍的RRMS患者，即CI 组，和未发生认知障碍的RRMS 患者，即无CI 组。其中 CI 组共 39 例，男 12 例，女 27 例，年龄21~48岁，平均（30.28±5.24）岁，文盲4例，小学10例，中学及以上学历25 例。而CI 组又根据MMSE 评分结果分为轻度 CI 组 20 例，中度 CI 组 13 例，重度 CI组 6 例。而无 CI 组共 41 例，男 14 例，女 27 例，年龄22~49 岁，平均（31.27±4.88）岁，文盲 5 例，小学11 例，中学及以上学历25 例。两组在年龄、性别及文化程度方面相互匹配，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2.2 纯化miRNA 和总RNA 提取 所有受检者在清晨抽取3 ml 静脉血，室温自然凝固15 min，4 000/rmin 快速离心5 min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存备用。TRIpure 试剂提取总mi-RNA。将提取的 miRNA 置于 30 μl DEPC 水中，56℃水浴15 min 加速RNA 溶解。提纯后的miRNA使用M-MLV 逆转录试剂盒完成第1 链cDNA 合成，并使用miRNA 荧光检测试剂盒，采用SYBR Green嵌合荧光法的原理完成miRNA 荧光定量检测。以上操作过程均按照相关试剂盒说明书进行，反应体系为20 μl，引物设计使用Primer 5.0 软件完成，具体引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

定量PCR 的反应条件为：95℃处理5 min，95℃变性10 s，再经退火和延伸60℃36 s，重复进行40个循环。所有的数据使用ABI 7300 SDSvl. 2x System该软件处理，依靠软件的自动分析功能获取相应Ct值，采用2-ΔΔCt计算出目的基因相对含量，单样品进行3次测定后软件分析获取出相应Ct平均值。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0对所有数据进行分析，计量资料用表示，两独立样本均数间的比较采用t检验，多个独立样本均数间的比较采用ANOVA 单因素的方差分析，计数资料以百分比表示，两组间比较采用卡方检验，采用Pearson 检验对变量间的关系进行相关性分析，多因素分析采用二元回归Logistic 回归分析，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料对比 RRMS患者CI组在性别、年龄、病程长短、发作次数、吸烟、饮酒和高血压、冠心病、糖尿病等合并症方面与无CI组相比较差异无统计学意义（P>0.05，表2）。

表2 各组一般资料比较Tab.2 Comparison of general data in each group

2.2 各组miR-132、miR-146a 的相对表达量的比较 RRMS 患者CI 组的不同程度CI 亚组外周血清中miR-132 及miR-146a 的表达水平均明显高于无CI组，差异均有统计学意义（P<0.05）。CI组中各亚组比较，重度CI 组患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平较轻度CI 组和中度CI 组均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，表3）。

表3 各组外周血清miR-146a、miR-132相对表达量Tab.3 Relative expression levels of miR-146a and miR-132 in peripheral blood of each group

2.3 CI 组外周血 miR-132 及 miR-146a 相对表达量与MMSE 评分相关性分析 CI 组外周血miR-146a和miR-132 水平与MMSE 评分均呈负相关（r2=0.907 6，P<0.01，r2=0.916 7，P<0.01）。见图1。

图1 CI 组 MMSE 评分与 miR-146a、miR-132 相对表达量的相关性Fig.1 Correlation between MMSE score and relative ex⁃pression levels of miR-146a and miR-132 in CI group

2.4 Logistic 回归分析 将RRMS 患者是否合并CI作为因变量，有统计学意义的指标miR-146a、miR-132 的相对表达量作为自变量进行Logistic 回归分析发现，miR-146a、miR-132 为 RRMS 患者合并 CI 发生的独立危险因素，见表4。

表4 CI的Logistic回归分析Tab.4 Logistic regression analysis of CI

3 讨论

MS 作为一种以中枢神经系统的髓鞘脱失为主要特点的炎性自身免疫性疾病，研究普遍认为其属于自身免疫性疾病，相关文献报道，MS 伴有认知功能障碍的发生率高达65%，CI 通常影响多个不同的认知领域，在临床上表现出不同形式，比如信息的处理能力、近远时记忆力、执行力和注意力等［7］。部分研究者发现RRMS 患者N-乙酰门冬氨酸和谷氨酸-谷氨酰胺的神经递质代谢异常是引起CI 的原因，也有研究发现MS 患者的认知功能障碍与轴索广泛损害及神经元的变性相关［8-9］。虽然近年对MS伴发的CI研究逐渐深入，但目前就其造成认知功能障碍的相关机制仍不明确。而miRNAs 是一类内源性的有调控功能的非编码RNA，中枢神经系统的miRNAs 有潜在的免疫诱导作用［10］。近年研究发现，miRNA 在神经元分化、轴突形成、突触的可塑性过程及大脑的发育中发挥重要作用，并与大脑的记忆学习能力和认知功能紧密相关，在一些以记忆损害和进行性认知障碍为临床表现的神经退行性疾病中起关键作用［11-12］。

miR-146a 作为miR-146 家族一员，是一种对TLR及细胞因子的受体信号通路进行调控的内源性相关调节因子，能够通过负反馈调节多种炎症信号通路而参与多种疾病发生发展［13］。同时研究证实，miR-146a 在阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病患者脑部表达水平上调，且在患者外周血中发现miR-146a 的AA 型等位基因相对表达量的上调可增加AD 患者认知功能障碍的罹患率［14］。而作为大脑中主要功能物种的miR-132，其受到脑源性神经生长因子相应的刺激后开始上调，引起树突轴突的成长及突触的可塑性，从而在MS 及其他多种疾病的发生发展中发挥重要作用［15-16］。miR-132 对靶基因MecP2 的特异性负向调节，其过度表达会引起认知功能障碍及精神症状的出现［17］。已有研究表明，miR-146a、miR-132 在 MS 患者外周血中高表达［18］。本研究发现RRMS 患者CI 组的不同程度认知障碍亚组外周血中miR-132及miR-146a表达水平均明显高于无CI 组，而CI 组中各亚组进行比较，重度CI 组患者外周血清的miR-132、miR-146a 水平较轻度CI组和中度CI 组均明显升高，提示miR-146a、miR132参与了RRMS疾病进展，与既往研究相一致，同时本研究发现二者可能与RRMS 伴发的CI 严重程度有关，对 CI 组外周血 miR-132 及 miR-146a 相对表达量与MMSE 评分相关性分析，及对RRMS 患者合并CI发生的独立危险因素的Logistic回归分析发现，miR-132、miR-146a 与 MMSE 评分均呈负相关，且高表达的 miR-132 和 miR-146a 是 RRMS 患者 合并 CI 发生的独立危险因素，提示miR-132、miR-146a 的表达水平与RRMS 患者伴发的CI 有关，二者表达水平越高RRMS患者CI越重。

综上所述，miR-146a、miR-132 参与了 RRMS 患者CI发生的过程，可能与其炎症反应的调节和突触可塑性等生理功能相关，推测miR-146a 及miR-132有作为MS 神经行为生物学标志物的可能，为MS 伴发认知功能障碍的病患的诊断提供新的证据。