海南地区汉、黎民族父源性HLA-G 基因14 bp 缺失多态性及与重度PE 的关系

黄丽莉 夏可辉 唐 荣 郑林媚 （海口市妇幼保健院产科，海口570203）

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有疾病，全球发病率为5%~7%，每年导致全世界7 万多例孕产妇和50万例胎儿死亡［1］。重度PE作为PE严重阶段，伴有至少1种严重并发症，严重威胁孕妇和胎儿健康，是产科ICU中38%孕产妇死亡原因，但其病因和发病机制尚未阐明［2］。目前免疫调节和遗传易感性机制在国内外备受关注，认为PE是一种母胎间免疫失衡疾病，携带父源性基因的胎儿视为同种半异体移植物被母体排斥，从而导致疾病发生［3］。

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）基因是人类基因组中最具多态性的位点，在各类人群和民族中均有广泛研究。人类MHC 又称为人类白细胞抗原（human leucocyte anti‐gen，HLA），其编码分子表达于白细胞，主要功能是诱导免疫应答，调节免疫反应及选择适当T细胞库。过去几十年人群研究已确定HLA 与多种人类疾病相关，在携带特定HLA 等位基因（包括炎症、自身免疫性疾病和恶性肿瘤）个体中更为常见。因此，HLA基因和蛋白研究已成为人类学、移植和疾病相关性研究重要工具，HLA-疾病关联的潜在机制是目前研究热点。

HLA-G 作为非经典HLAⅠb 类分子，由绒毛外滋养细胞特异性表达，促进滋养细胞侵袭，抑制蜕膜NK细胞功能，维持母胎间免疫平衡［4］。已有报道提示 HLA-G 基因多态性与 PE 发病相关［5］。最近研究表明，HLA-G 基因外显子8 3'-UTR 14 bp 缺失/插入多态性影响HLA-G 转录并导致HLA-G 蛋白表达异常或下降，增加PE 发病风险［6］。母体和胎儿遗传因素均影响PE 发病率，且一半胎儿基因来自父亲，因此父源性基因在PE 发病中起重要作用［7］。张展等［8］研究显示，父源性HLA基因14 bp缺失多态性可能与早发型重度PE 发病相关。目前国内外不同民族PE 间父儿HLA-G 14 bp 多态性比较研究尚未见报道。

本研究通过检测海南地区汉、黎族重度PE患者父、儿HLA-G 基因14 bp 多态性，并联合父、儿基因型配伍分析，探讨在海南地区HLA-G 基因14 bp 插入/缺失多态性是否为汉、黎族的PE 易患基因，进一步从免疫遗传学角度探讨汉、黎民族PE发病的遗传学特征，以及是否存在种族差异。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选择2017年1月至2019年10月我院和海南省人民医院分娩的产妇，选取正常妊娠者汉族父、儿100 对，黎族父、儿80 对为对照组。同期确诊为重度PE 的患者汉族父、儿84 对，黎族父、儿74对为病例组。重度PE诊断标准参照第8版《妇产科学》［9］。分别无菌抽取父亲外周血和脐静脉血各2 ml置于EDTA抗凝管，-20℃冻存待检。所有研究对象（汉、黎族患者）要求三代居住海南地区，无异族通婚史、无血缘关系及PE 家族史。4 组均为自然受孕、单胎妊娠、剖宫产分娩、初产妇，并排除其他产科并发症及内外科并发症，所有患者均随访至产后12周。所有参与者知情同意。

1.1.2 主要试剂与仪器 DNA 提取试剂盒、100 bp DNA Ladder（北京天根公司）；紫外分光光度计（美国赛默飞世尔）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取及浓度和纯度测定 取冰冻全血室温解冻，采用DNA 提取试剂盒提取样本DNA，紫外分光光度法测定DNA 浓度和纯度。DNA浓度调整至100 ng/μl，-80℃保存备用。

1.2.2 HLA-G 基因扩增和电泳 采用PCR 对HLA-G 基因进行扩增，引物参照文献［10］，引物序列 ：F：5'-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3'；R：5'-GGAAGGAATGCAGTTCAGCTGA-3'，由 上 海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 总反应体积为 25 μl：12.5 μl Taq PCR Master Mix（2×），2 μl HLA-G 引 物（5 μmo/lL）、1 μl DNA、9.5 μl dH2O。PCR 扩增条件：94℃ 预变性5 min，94℃ 30 s，64℃ 1 min，72℃ 2 min，共 35 个循环，72℃ 终末延伸10 min。取5 μl PCR 产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（100 V，45 min），溴化乙锭染色20 min，Gel logic 2000图像系统拍照。

1.2.3 HLA-G 14 bp 缺失插入多态性分型 PCR产物包括14 bp 插入/缺失杂合子（+14 bp/-14 bp）、14 bp 缺失纯合子（-14 bp/-14 bp）、14 bp 插入纯合子（+14 bp/+14 bp），采用 100 bp DNA Ladder 作为DNA Marker。选取缺失纯合子和插入纯合子PCR原液，送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，采用GenBank Blast比较测序结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用卡方检验测定各组HLA-G 基因型频率及基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡，4 组（汉族正常妊娠组、汉族重度PE 组、黎族正常妊娠组、黎族重度PE 组）父亲和新生儿HLA-G 等位基因和基因型频率均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群体代表性。采用卡方检验或Fisher精确检验比较病例组和对照组HLA-G 等位基因和基因型频率。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉、黎族父代和子代第8 外显子14 bp 多态性等位基因频率、基因型频率比较 汉族父代正常对照组与黎族父代正常对照组、汉族子代正常对照组与黎族子代正常对照组HLA-G 14 bp 等位基因和基因型频率差异均无统计学意义（P>0.05，表1、2）。

表1 父代汉、黎族正常妊娠组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.1 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers of Han and Li in control group（%）

2.2 父代HLA-G 基因第8 外显子14 bp 多态性等位基因频率、基因型频率比较 汉族父代重度PE组等位基因+14 bp 频率为52.4%（88/168），-14 bp为47.6%（80/168），正常妊娠组分别为49%（98/200）、51%（102/200），差异无统计学意义（χ2=0.418，P=0.518）；两组间基因型频率差异也均无统计学意义（P>0.05，表3）。黎族重度PE 组和正常妊娠组父亲HLA-G 14 bp 缺失等位基因分布虽无显著差异，但有差异性趋势（P=0.060），两组父亲基因型分布无统计学差异（表4）。

表3 汉族父代正常妊娠组和重度PE组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.3 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Han in control group and severe PE group（%）

表4 黎族父代正常妊娠组和重度PE组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.4 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fathers Li in control group and severe PE group（%）

2.3 子代HLA-G 基因第8 外显子14 bp 多态性等位基因与基因型频率比较 汉族子代重度PE 组等位基因+14 bp 频率为51.2%（86/168），-14 bp 为48.8%（82/168），正常妊娠组分别为46%（92/200）、54%（108/200），差异无统计学意义（χ2=0.985，P=0.321）；两组间基因型频率差异也无统计学意义（P>0.05，表5）。黎族重度PE 组新生儿HLA-G-14 bp 频率为37.8%，明显低于正常妊娠组的 55%（χ2=9.096，P=0.003），且重度 PE 组新生儿-14 bp/-14 bp 基因型频率为18.9%，显著低于正常妊娠组的43.8%（χ2=10.926，P=0.001，表6）。

表2 子代汉、黎族正常妊娠组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.2 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Han and Li in control group（%）

表5 汉族子代正常妊娠组和重度PE组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.5 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14bp of fetuses of Han in control group and severe PE group（%）

表6 黎族子代正常妊娠组和重度PE组HLA-G 14 bp等位基因及基因型频率（%）Tab.6 Allele and genotype frequencies of HLA-G 14 bp of fetuses of Li in control group and severe PE group（%）

2.4 汉族和黎族父、子HLA-G第8外显子14 bp多态性基因型配伍频率比较 汉族重度PE组父、子均为缺失纯合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍频率，与正常妊娠组差异无统计学意义（P>0.05，表7）。黎族重度PE组父、子均为缺失纯合子（-14 bp/-14 bp）的基因型配伍，频率为21.1%（4/19），显著低于正常妊娠组的65.5%（19/29），两组差异有统计学意义（P=0.003）。汉族和黎族其他基因型配伍频率在正常妊娠组和重度PE组间均无统计学意义（P>0.05，表8）。

表7 汉族正常妊娠组和重度PE 组父、儿HLA-G 基因型配伍频率［例（%）］Tab.7 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa⁃thers and fetuses of Han in control group and se⁃vere PE group［n（%）］

表8 黎族正常妊娠组和重度PE 组父、儿HLA-G 基因型配伍频率［例（%）］Tab.8 HLA-G genotypes frequencies of HLA-G of fa⁃thers and fetuses of Li in control group and severe PE［n（%）］

3 讨论

妊娠是一种成功的同种半异体移植过程，胎儿虽携带一半与母体基因无关的父源性基因，却不被母体排斥，母胎免疫耐受是天然同种异体免疫耐受现象［11］。HLA-G 属于介导母胎间免疫抑制的非经典HLA-Ⅰ类分子，参与抑制子宫和外周血NK 细胞和CD8+T 细胞毒活性，CD4+T 细胞的同种异体增生反应抑制树突状细胞成熟和激活调节性T细胞。除免疫抑制活性外，HLA-G 还参与绒毛外滋养细胞浸入母体子宫蜕膜过程，确保胎盘正常发育。

研究发现，PE 患者HLA-G 表达异常下降，推测HLA-G 与其发病相关［12］。进一步研究表明，含有14 bp DNA 序列的HLA-G 等位基因与胎盘HLA-G mRNA 低表达有关，且这一多态性与PE 发生有关［13］。研究尚未证实母亲 HLA-G 14 bp 多态性与PE 相关，因此，分析 HLA-G 基因 14 bp 多态性与 PE是否相关，仅从母亲角度出发可能存在一定局限性。一组瑞典孕妇分析表明，13%病例中，父亲遗传因素增加PE的患病风险，可能与母亲遗传因素相互作用有关［14］。李红等［15］认为不同母/儿 HLA-G 14 bp 多态性基因型配伍影响母体对同种异体胎儿的接受程度，且胎儿HLA-G-14 bp 与早发型重度PE风险降低有关。

流行病学调查结果显示，初次妊娠、工具避孕或人工授精后妊娠者发生PE 的风险增加［16］。OLAYEMI 等［17］观察到孕前性生活时间短也增加PE发生风险，反之延长母体对精子的暴露时间和频率可明显降低PE发病率，以上现象原因可能为母体未能适应胎儿所携带的父方抗原所致，推测父本遗传物质在子痫前期发生发展中发挥重要作用。研究表明，父亲HLA+14 bp/-14 bp 可增加PE 风险。沈彦婷等［18］通过对母亲、父亲及胎儿 HLA-G14 bp 多态性与PE 的关系进行研究，发现父（+14 bp/+14 bp）/儿（+14 bp/+14 bp）是子痫前期的危险因素。国外学者HYLENIUS等［19］研究发现，重度PE初产妇的胎儿优先遗传父亲HLA-G+14 bp 等位基因，与PE 易感性相关。但也有研究比较正常妊娠组和PE 组新生儿HLA-G 14 bp 多态性等位基因和基因型频率，结果显示差异无统计学意义［20］。分析结果不一致的原因可能是各项研究存在种族差异，对照组和病例组入选标准参差不齐以及PE 严重程度不一，导致HLA-G 14 bp多态性研究难以比较。

本研究通过测定海南地区汉、黎族人群父、子HLA-G14 bp 基因型、等位基因，并对父、子HLA-G 14 bp 基因型进行配伍分析，进一步阐述其与重度PE的相关性，以及是否存在种族差异，结果显示，汉族正常妊娠组及黎族正常妊娠组父代和子代HLA-G 14 bp的等位基因与基因型频率差异无统计学意义，表明HLA-G 14 bp 多态性在正常情况下不存在种族差异。进一步研究不同种族间HLA-G 14 bp 多态性在疾病状态下是否存在差异，研究表明，汉族组父、子代HLA-G 14 bp 插入/缺失的等位基因及基因型分布在重度PE 组和正常妊娠组无统计学差异（P>0.05），联合父/儿基因型配伍后未发现统计学意义，提示汉族中该位点对PE发病意义较小。黎族重度 PE 组父亲 HLA-G 14 bp 频率和-14 bp/-14 bp 基因型频率分别为40.5%、25.7%，与正常对照组（51.2%、32.3%）差异无统计学意义，但均有低于对照组的趋势（P=0.060，P=0.157）。而黎族重度PE组新生儿HLA-G-14 bp 频率和-14 bp/-14 bp 基因型频率显著低于黎族正常对照组。联合父/儿基因型配伍发现，重度 PE 组父（-14 bp/-14 bp）/儿（-14 bp/-14 bp）基因型配伍频率显著低于正常对照组（P=0.003），提示父儿均为缺失纯合子可降低母亲患重度PE风险。

综上所述，HLA-G 14 bp 多态性的类型、发生频率及父儿基因型配伍频率等在不同地域人群中呈种群差异性分布。汉族HLA-G基因14 bp 缺失多态性与重度PE 无相关性。黎族父儿均为缺失纯合子可降低母亲患重度PE的风险，推测黎族父（-14 bp/-14 bp）/儿（-14 bp/-14 bp）基因型可能与重度PE易感性相关。