蝙蝠携带病毒机制的研究概况和进展①

周 浩 马 龙 姚新生 （遵义医科大学免疫学教研室，贵州省高校免疫分子工程中心，遵义563000）

1 蝙蝠携带病毒概况

蝙蝠是哺乳纲翼手目动物，世界范围内存在的蝙蝠约1 240 种，占现存哺乳动物种类的20%以上，是仅次于啮齿目动物的第二大类哺乳动物，是唯一一类具有飞行能力的哺乳动物，除极地和大洋洲部分岛屿外，遍布于全世界，是除人类外分布范围最广的哺乳动物类群，热带和亚热带分布最多［1-2］；蝙蝠既可栖息于自然环境，也可寄居于人造环境，由于其飞行能力，蝙蝠与人类接触十分密切，广泛的分布及其与人类的高接触率有助于蝙蝠体内携带病毒在人群中传播。

近年埃博拉、西尼罗河热、严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和高致病性禽流感等一系列突发公共卫生事件表明，以野生动物为宿主的人畜共患病毒不仅威胁野生动物自身生存，且严重威胁人类健康［3-7］。对1940~2004 年全球335 例新发传染病病例进行分析发现，60.3%新发传染病病例由人畜共患病毒引起，其中71.8%病原体来自野生动物［8］。既往研究普遍认为灵长类和啮齿类是携带及传播人畜共患病毒的主要宿主，但对世界范围内各物种携带病毒丰度研究发现，蝙蝠携带病毒比例位居哺乳动物榜首［9］。

既往大部分蝙蝠和病毒研究集中于狂犬病毒与其他弹状病毒科病毒，1911 年首次在吸血蝠中发现了狂犬病毒，随后发现狂犬病毒与多种蝙蝠均有联系［10］。研究表明，除莫科拉病毒外，其他狂犬病病毒均以蝙蝠为其自然宿主，感染陆生食肉动物的所有狂犬病病毒均由蝙蝠相关狂犬病病毒跨物种传播，人类由于蝙蝠-狂犬病病毒感染导致死亡的案例在美洲、欧洲、澳大利亚和非洲均时有发生［11-13］。近年在人体和蝙蝠中发现多种新型病毒，如1990年澳大利亚和马来西亚爆发的亨德拉病毒和尼帕病毒对严重威胁人类生命，而狐蝠是这两种烈性病毒的主要宿主［14-15］。在中国广东和香港两地由冠状病毒引发的SARS 也导致了严重后果，随后在蝙蝠体内分离或发现了马尔堡病毒、坎帕耳病毒、马六甲病毒等100 余种病毒，大部分为RNA 病毒，关于蝙蝠体内携带DNA 病毒的报道较少。2008 年首次从日本果蝠中分离出第一株蝙蝠腺病毒［16］；2010 年中国石正丽课题组采用大卫鼠耳蝠肾原代细胞分离出新的蝙蝠腺病毒BtAdv-TJM，并对其基因组及潜在宿主范围进行了全面研究［17］。蝙蝠体内携带多种烈性病毒，其病毒传播方式备受关注。多项证据表明，单峰驼在中东呼吸道综合征（middle east re‐spiratory syndrome，MERS）冠状病毒传播中可能作为中间宿主，但鉴于MERS 冠状病毒与其他蝙蝠来源冠状病毒（如Bat CoV HKU4、HKU5、中东、非洲、欧洲及亚洲分离鉴定的病毒）在进化上关系密切，因此普遍认为蝙蝠是MERS 冠状病毒的自然宿主［18-21］。ZHENG 等［2］分别对 4 个地区的 6 种蝙蝠粪便样本进行病毒宏基因组学分析，发现蝙蝠中存在的甲型流感病毒和冠状病毒与人类高度相似，表明可能存在跨物种传播。2013年，GE 等［6］从云南省中华菊头蝠粪便样本中分离获得一株活的SARS 样冠状病毒，是目前SARS冠状病毒来源于蝙蝠的最强证据，且研究结果证明SARS冠状病毒在跨物种感染中无需中间宿主。

近年研究者已逐渐认识到蝙蝠在携带及传播病毒方面的重要公共卫生意义，开始关注蝙蝠本身、蝙蝠病毒及其携带病毒的机制［22-23］。蝙蝠物种的多样性和部分独特的生物特征使其成为多种病毒的天然宿主［24］。蝙蝠携带多种病毒，但实验感染和自然感染的蝙蝠鲜有病毒感染导致的死亡发生，鲜有携带病毒导致蝙蝠严重损伤的报道，因此蝙蝠抗病毒机制研究备受关注，目前蝙蝠抗病毒机制大致可分为生理因素、免疫因素及待探索机制［25］。蝙蝠免疫相关研究及抗病毒可能机制见表1。

表1 蝙蝠免疫系统及抗病毒机制相关研究进展Tab.1 Research progress on immune system and anti-viral mechanism of bats

2 蝙蝠生理性抗病毒机制

蝙蝠是具有飞行功能的哺乳动物，其飞行能力可能在抗病毒过程中起重要作用。多种蝙蝠在季节性迁徙时会进行长距离飞行，如鼠耳蝠会从冬眠地点迁徙200~400 英里，墨西哥无尾蝙蝠在得克萨斯州和新墨西哥州越冬地点迁徙至少800 英里［10］。蝙蝠长时间飞行过程中的高代谢需求可导致体温升高至 40℃ 左右［23］。CANALE 和 HENRY 提出高温将阻止病毒复制，提高免疫应答效率［26］；多种动物体温升高与降低与疾病持续时间和存活率相关。体温达到类似哺乳动物发烧过程中，哺乳动物核心体温维持在 38℃~41℃［10，27］。高体温增强免疫应答频率，包括固有免疫和适应性免疫系统组成，如增加干扰素生成、增强辅助性T 细胞表达及细胞毒活动、增强抗体生成、自然杀伤细胞补体活动，因此部分学者认为极高体温可能导致蝙蝠在感染早期抵御部分病原体。

部分温带蝙蝠的重要特征是其蛰眠和冬眠能力，夏天或气温较高时进入短暂日蛰眠而在冬季进入季节性冬眠状态，冬眠或蛰眠时的免疫状态变化备受关注。其他哺乳动物研究表明，冬眠可同时影响先天和获得性免疫系统。研究认为，蝙蝠免疫功能在休眠期间减弱，冬眠期间免疫能力被显著抑制，在宿主能量保存方面起重要作用［10］。同时，多数病毒在低温下无法充分复制，感染机会较小。

3 蝙蝠免疫系统组成和抗病毒机制

3.1 蝙蝠免疫系统组成 免疫系统包含固有免疫系统和适应性免疫系统，在生理结构上，蝙蝠是典型的哺乳动物，具有骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结等免疫器官。最近对蝙蝠脾脏结构深入研究发现其含有白髓、红髓等结构，生发中心结构也与哺乳动物类似［28］。虽然目前没有专门用于蝙蝠特异型细胞检测的试剂，但形态和物理化学法证明蝙蝠体内细胞群体与哺乳动物类似［29］。采用扫描电镜和分子黏附性质在印度果蝠脾脏和淋巴结中分离出T、B淋巴细胞和巨噬细胞，并证实其巨噬细胞/B细胞/T细胞比例为1∶2∶9，与小鼠巨噬细胞/B 细胞/T 细胞比例类似（1∶1∶8）。此外，TURMELLE 等［30］通过注射T细胞有丝分裂原PHA 发现，多种免疫细胞，包括淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及巨噬细胞存在于巴西无尾蝙蝠。SARKAR等［31］在果蝠中检测到滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells，FDCs），而FDCs 在提呈抗原及诱导维持记忆性免疫应答方面具有重要作用，并有证据证实部分病毒在与FDCs 复合时可保持传染性，但FDCs 是否在蝙蝠抗病毒感染中发挥作用需进一步研究。目前对蝙蝠细胞亚群的检测较少，已知细胞亚群形态特征及功能也有待在其他种类蝙蝠中进一步考证。近年蝙蝠基因组研究日益广泛，包括对埃及果蝠、马来大狐蝠、大卫鼠耳蝠等十几种蝙蝠均进行了宏基因组测序，随着测序技术进步，得到的蝙蝠基因组也越来越完整，虽然在部分免疫应答基因上发生了扩增及压缩，但就目前各种蝙蝠的相关信息来看，蝙蝠无论是在器官构造、细胞集群及主要抗病毒基因家族上均与普通哺乳动物无显著差别［32-33］。因此需进一步研究其免疫系统以阐明蝙蝠无症状携带病毒的机制。

3.2 蝙蝠固有免疫系统与抗病毒应答 固有免疫可通过模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）识别病原微生物部分保守成分，即病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）激活受体特异性信号转导通路，产生非特异性抗病原微生物反应，包括Toll 样受体（Toll-like re‐ceptors，TLRs）及RLHs 均在抗感染第一道防线中发挥重要作用，而RIG-1-IFN-STAT-1 信号通路对细胞抗病毒产生重要影响。目前蝙蝠固有免疫研究已取得显著进展，研究者猜测蝙蝠可无症状携带病毒的可能原因是蝙蝠能够在病毒感染早期快速应答，通过特定固有免疫抗病毒机制抑制病毒复制［34］。狐蝠和果蝠中发现在其他哺乳动物中高度保守的TLRs，并对狐蝠中发现的TLRs 进行定量组织表达分析，发现TLRs1~10 与人类同源，另外还有1 个完整的TLR13 假基因，目前仅在啮齿类动物中存在TLR13，而TLR13 敲除小鼠对水泡性口炎病毒更为敏感；此外野生中国马蹄蝠中发现的RIG-1和IFN-β与人、小鼠、猪及恒河猴具高度同源，而RIG-1 可检测细胞质中的病毒核糖核酸，并产生Ⅰ型干扰素控制病毒感染［35-38］。病毒感染后最早的免疫反应之一是产生干扰素，Ⅰ型干扰素是最重要的抗病毒免疫因子之一［39］。2015年研究者首次在体外证明IFN-β在大卫鼠耳蝠中的抗病毒活性，而PAVLOVICH 发现埃及果蝠的Ⅰ型干扰素家族明显扩增，而其携带46 种Ⅰ型干扰素基因数是狐蝠的2 倍，主要的扩增家族是IFN-ω 家族；随后的体外实验中用水泡性口炎病毒感染埃及果蝠细胞，发现IFN-ω4阻止病毒感染，证明其干扰素可诱导一种减少免疫相关病理反应的应答；尽管目前各种实验证实干扰素确实在蝙蝠抗病毒过程中发挥重要作用，但干扰素刺激基因（stimulator of interferon genes，STINGs）关键结合位点的保守氨基酸缺失也导致IFN-β 表达降低，因此蝙蝠的干扰素抗病毒作用有待商榷［1，33，40］。

NK 细胞可在固有免疫系统中消灭被病毒感染的细胞，NK 细胞有2种受体，一是促进NK 细胞杀伤作用的激活型受体，另一种是阻碍NK 细胞应答的抑制型受体。虽然既往研究认为NK 细胞受体在大部分蝙蝠中是缺失的，但研究证实，埃及果蝠中存在多个NK 细胞受体抑制基因，如NKG2-13 和NKG2-14，而这2 个基因在外周血和体液中大量存在，并主要激活抑制型信号通路，随后进一步筛查其他蝙蝠基因组，发现多个类似 NKG2 的基因［33，41］。同时，埃及果蝠中的MHCⅠ型分子基因在基因组中发生大量扩增，并与小鼠和人类的传统MHCⅠ坐落位点相比，埃及果蝠的MHCⅠ型分子分布更为广泛；作者认为这些经典MHC位点外的Ⅰ型分子基因扩增产生配体冗余，直接提高NK 细胞激活阈值，最终导致NK 细胞较低的活动性；另有研究者从蝙蝠携带的病毒中发现，MHCⅠ型分子结合肽具有额外表面锚定位点，这些额外位点可加强T 细胞识别并通过抑制病毒复制导致更低的突变率［42］。以上发现为进一步研究蝙蝠病毒感染后无症状的机制提供了重要信息。

3.3 蝙蝠适应性免疫系统与抗病毒应答 适应性免疫系统在机体应对病原体入侵中处于核心地位，病毒逃逸固有免疫防线后面对适应性免疫的第二道防线。适应性免疫应答包括由T细胞介导的细胞免疫和B 细胞介导的体液免疫，由于适应性免疫在抗病毒方面发挥重要作用，因此蝙蝠适应性免疫系统研究备受关注。目前已明确在蝙蝠体内存在T/B细胞介导的免疫反应，对蝙蝠T 细胞类群及功能的研究较少，尤其是没有针对T 细胞亚群分析或分选的试剂极大限制了蝙蝠T 细胞研究。20 世纪70 年代体外实验发现，多种蝙蝠细胞能够针对T 细胞有丝分裂原产生应答，并相比于小鼠应答时间，蝙蝠应答时间更长。而蝙蝠B 细胞应答研究在开始于20世纪60年代，蝙蝠（大棕蝠）针对抗原刺激产生的抗体滴度比其他实验室动物（兔和豚鼠）更低，产生抗体的时间更长，但明确证实蝙蝠类似于其他哺乳动物，能够针对抗原刺激产生抗体，且蝙蝠在应答机制上与小鼠类似，如多次免疫发现，大棕蝠体内产生的抗体亲和力逐渐升高，提示蝙蝠产生抗体伴随高频突变。多个实验均证实，采用抗原刺激野生蝙蝠和刺激实验蝙蝠均能够监测到针对抗原刺激发生抗体参与免疫应答［43-48］。CHAKRABORTY 和WELLEHAN 等［49-50］实验证明，蝙蝠针对抗原刺激产生相应抗体同时，其初次应答及再次应答时间较其他实验动物延长。

2011 年，BUTLER 等［51］对 4 种蝙蝠体内抗体类型进行鉴定，包括IgM、IgG、IgD、IgA 和IgE 5 种哺乳动物经典抗体，并对免疫球蛋白重链基因座结构解析发现，其抗体类型与哺乳动物大致相同，因此认为蝙蝠适应性免疫系统进化方向与哺乳动物无显著差异，但蝙蝠在生物界独特的抗病毒机制尚未阐明，鉴于目前有限的蝙蝠适应性免疫系统信息，未来对其研究将对人类抗病毒产生重要影响。

4 展望

蝙蝠作为一种数目众多、分布广泛的动物，是百余种病毒的天然宿主，其在携带并传播病毒方面的作用备受关注，而其“携带病毒而能耐受”的特点，提示其与蝙蝠特殊的免疫系统相关。目前对蝙蝠免疫系统的有限解析是进一步探索其抗病毒机制的难题。最近对蝙蝠细胞谱系方面的相关研究加深了其与病毒相互作用的认识［52］。2013 年，中国、澳大利亚和美国研究者合作完成了对澳大利亚狐蝠和中国大卫鼠耳蝠的基因组测序工作［32］，越来越多的实验室进行不同蝙蝠基因组测序工作和数据共享，为研究蝙蝠固有和获得性免疫系统组成和特征提供了基础，课题组在国家自然科学基金资助下，采用高通量测序技术解析蝙蝠T、B 细胞受体库特征，探讨蝙蝠在与病毒相互作用中特异性免疫应答系统产生耐受的可能机制，为全面解析蝙蝠免疫系统组成和应答机制提供基础数据。人类与病毒关系研究中，蝙蝠携带病毒耐受的机制可为研究人体抗病毒免疫应答机制、控制病毒感染、病毒疫苗开发等提供新思路和措施。