ARA55过表达激活内源性线粒体凋亡通路诱导CNE2鼻咽癌细胞凋亡①

崔兆磊 辛小琴 陈 燕 （福建医科大学附属肿瘤医院检验科生物化学分子生物学研究室，福州350014）

鼻咽癌是一种发生于鼻咽黏膜的恶性肿瘤，以发病地域性强，恶性度高，易转移等为特点［1］。由于缺乏灵敏度高的标志物，很多患者失去早期诊断的机会。雄激素受体相关蛋白55（androgen receptor coactivator 55 kD protein，ARA55）是雄激素受体辅助因子（androgen receptor coactivator，ARA）的重要成员之一，其表达主要见于人前列腺基质细胞，可作为一种辅助激活因子通过介导蛋白间的相互作用或磷酸化水平等调节雄激素受体的转录活性［2］。目前关于ARA55 在恶性肿瘤中发挥怎样的生物学功能研究者尚未达成一致。研究显示，ARA55 可能是一种抑癌基因，因其在部分恶性肿瘤包括前列腺癌、胰腺癌以及食管鳞癌等的癌组织表达明显降低，而在相应的癌旁组织中表达升高［3-5］。然而有研究发现ARA55 在癌细胞发生侵袭转移时的形态改变及可塑性等过程中发挥重要作用［6］。目前，ARA55 在鼻咽癌的发生与发展中发挥的作用尚不明确。本研究拟探讨ARA55基因/蛋白表达上调对CNE2 鼻咽癌生长增殖和侵袭迁移等生物学特性的影响，同时探讨相应的分子机制，以期明确ARA55在鼻咽癌发生发展中发挥的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料 pCMV-ARA55-EGFP 重组质粒为前期构建［7］。RPMI1640 培养基、PBS 缓冲液、双抗（Hy‐clone 公司）。ZLip2000 转染试剂盒（北京庄盟）、CCK-8（日本同仁）、Annexin V-PE/7-AAD 凋亡试剂盒（南京凯基）；DNA Ladder 抽提、BCA 法蛋白定量、SDS-PAGE 凝胶和RIPA 蛋白提取等试剂盒、鼠抗人Caspase-3、Cytochrome C 和 β-actin 单克隆抗体等均为碧云天产品。鼠抗人ARA55单克隆抗体、兔抗人Caspase-9 多克隆抗体（Santa Cruz 公司）。兔抗人Bcl-2和Bax单克隆抗体（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养条件、质粒转染 人CNE2 鼻咽癌细胞为本实验室保存。培养基为RPMI1640（含10%FBS 及1%双抗），细胞培养于含5%CO2饱和湿度的37℃恒温箱，每3~5 d 传代1 次。前期构建的pCMV-ARA55-EGFP 重组质粒经ZLip2000 转染至CNE2 细胞。实验设ARA55 过表达组（pCMVARA55-EGFP）、空载体组（mock control）和空白对照组（blank control）。质粒转染后24~48 h 经荧光显微镜观察是否有EGFP的表达，判断质粒是否转染成功。

1.2.2 CCK-8 比色实验 选用96 孔培养板，每孔接种 5 000 个对数期的 CNE2 细胞，总体积 100 μl，各组细胞置于培养箱中培养。设定时间点，在培养的24 h、48 h、72 h 加入CCK-8 试剂（10 μl/孔），继续培养2~3 h。检测时需设置酶标仪双波长（450 nm和630 nm）模式，在此模式下检测每孔细胞的OD 值（OD 值的大小与细胞的数量成正比），绘制细胞生长曲线，横轴为培养时间，纵轴为检测的OD 值。实验每组含3个复孔，重复3次。

1.2.3 划痕修复实验 实验于6孔培养板中进行，每孔加 5×105个 CNE2 细胞，培养约 8～12 h，保证细胞单层不重叠，贴壁平铺，细胞融合率应该接近100%。选用无菌加样枪的吸头（200 μl 规格）垂直划痕（用力尽量均匀，以保证划痕边缘整齐），用PBS洗涤，加入不含FBS 的RPMI1640 培养基，细胞培养于含5% CO2饱和湿度的37℃恒温箱。于培养不同时间点显微镜下观察拍照。

1.2.4 Transwell 小室体外侵袭迁移实验 侵袭实验时，按1∶5体积比在无FBS 的RPMI1640培养基中加入Matrigel 胶以检测细胞的侵袭能力。在冰块上充分混匀后，每个小室的上腔室各加100 μl（3 个室），37℃孵育4~5 h。在每孔中加入50 000个CNE2细胞，下腔室中加入500 μl 的RPMI1640 培养基（含FBS的浓度为20%）。培养的不同时间点取出小室，用PBS 洗涤2~3 次，滴加浓度为5%的戊二醛固定20 min 以上。用Giemsa 染色液常温染色5~10 min，显微镜统计结果［8］。Transwell 小室迁移实验中不需用Matrigel胶包被基底膜，其他步骤同侵袭实验。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 在重组质粒转染72 h后，用胰酶消化各组细胞，PBS洗涤后离心收集细胞，细胞计数仪调整细胞密度为5×105个/ml；按试剂盒相应步骤加入Binding Buffer、Annexin V-PE染液、7-AAD染液等，尽快于流式细胞仪检测［9］。

1.2.6 DNA 片段电泳检测细胞凋亡片段生成情况 收集约1.0×106个细胞，胞重悬于PBS 中，依次加入RNase A，蛋白酶K，裂解液B，无水乙醇等提取基因组DNA，加入洗脱液约100 μl，在12 000/rmin条件下离心1 min，采用1%琼脂糖凝胶电泳分析，18 V 电泳 4~6 h［10］。

1.2.7 免疫印迹实验 细胞总蛋白的提取采用RIPA蛋白裂解液，BCA法蛋白定量。配置10%分离胶和5%浓缩胶，电泳分离目的蛋白，110 V 恒压电转移至PVDF 膜。用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗的浓度分别为：Bcl-2（1∶1 000），Bax（1∶300），Cy‐tochrome C（1∶500），Caspase-9（1∶200），Cleaved cas‐pase-3（1∶300），β-actin（1∶1 000）。4℃ 孵育过夜。用 TBST 洗 涤 吸 附 蛋 白 的 PVDF 膜 3 次 ，加 入 1∶10 000 TBST稀释的二抗（HRP标记的羊抗兔或抗鼠抗体），放在摇床室温环境中继续孵育1~2 h，加ECL显色液（A、B 液）后于蛋白成像仪中曝光显影。βactin 为内参照蛋白，蛋白进行相对定量采用Image J软件。

2 结果

2.1 pCMV-ARA55-EGFP转染上调CNE2细胞中外源 性 ARA55 的表 达 CNE2 细 胞转 染 pCMVARA55-EGFP 重组质粒 24 h 后即可观察到 EGFP 的表达，荧光主要位于胞质（图1）。免疫印迹实验在pCMV-ARA55-EGFP 组细胞中可检测到分子量约为80 kD的融合蛋白ARA55-EGFP的表达（图1）。

图1 CNE2 细胞转染过表达重组质粒后ARA55-EGFP 融合蛋白的表达Fig.1 Expression of ARA55-EGFP fusion protein in re⁃combinant plasmids transfected CNE2 cells

2.2 外源性ARA55 表达抑制CNE2 细胞生长增殖 采用CCK-8 比色绘制细胞增殖曲线，结果显示，随时间的延长pCMV-ARA55-EGFP 组CNE2 细胞增殖受到抑制，72 h 的 OD 值为 0.540±0.031，而pCMV-C-EGFP 组和空白对照组 72 h 的 OD 分别为0.796±0.024 和 0.861±0.010。 ARA55 过 表 达 组48 h 和 72 h 的 OD 值与 pCMV-C-EGFP 组相比，差异均具有统计学意义（图2）。

图2 基于CCK-8实验绘制的细胞生长曲线Fig.2 Cell growth curve based on CCK-8 testing

2.3 ARA55 过表达抑制CNE2 细胞的体外迁移能力 划痕修复实验显示（图3），ARA55表达上调后，pCMV-ARA55-EGFP 组出现迁移的CNE2 细胞数量明显低于空载体组（P<0.01），说明外源性ARA55可抑制CEN2细胞的体外迁移。

图3 划痕修复实验检测ARA55 过表达对CNE2 细胞体外迁移能力的影响Fig.3 Effects of ARA55 restoration on CNE2 cell migration assessed using wound healing migration assay

2.4 ARA55 对CNE2 细胞体外侵袭迁移能力的影响 体外侵袭实验结果可见（图4），pCMV-ARA55-EGFP 组发生侵袭和迁移的CNE2 细胞数量显著少于空载体组和空白对照组，说明ARA55过表达可以抑制CNE2细胞的体外侵袭和迁移能力。

图4 Transwell 小室实验检测ARA55 过表达对CNE2 细胞体外侵袭迁移能力的影响Fig.4 Transwell invasion assay assessed effects of ARA55 overexpression on CNE2 cell migration and invasion

2.5 ARA55过表达诱导CNE2细胞凋亡 采用An‐nexin V-PE/7-AAD 双荧光标记结合FCM 检测CNE2细胞的凋亡率（早期+晚期凋亡），结果显示转染48 h后ARA55 过表达组的细胞总凋亡率可达52.8%，而空载体组凋亡率仅为7.2%（图5）。DNA 梯状电泳结果显示，随时间延长，ARA55 过表达组“梯状”DNA 片段化程度越来越明显。以上结果说明，过表达外源性ARA55可诱导CNE2细胞发生凋亡。

图5 Annexin V-PE/7-AAD 双荧光标记结合FCM 及DNA ladder分析细胞凋亡情况Fig.5 Apoptosis analysis by Annexin V-PE/7-AAD dou⁃ble staining/FCM and DNA ladder

2.6 免疫印迹检测凋亡相关蛋白的表达变化 免疫印迹结果显示，转染72 h 后，相对于其他两对照组，ARA55 过表达组 Bcl-2 表达量显著下调，Cyto‐chrome C、Caspase-9 的剪接体和激活型 Caspase-3 的表达量显著升高，而各组间Bax 表达量变化差异无统计学意义（图6）。

图6 免疫印迹检测ARA55 过表达后凋亡相关蛋白的表达改变Fig.6 Changes of apoptosis-related proteins in response to ARA55 overexpression detected using immunob⁃lotting

3 讨论

ARA55是最初从TGF-β1诱导的小鼠MC3T3-E1成骨细胞中被鉴定发现的蛋白分子，因此又称为转化生长因子 β1 诱导因子 1（transforming growth fac‐tor beta-1-induced transcript 1 protein，TGF-β1I1）［2］。ARA55属于LIM 蛋白家族，蛋白结构与桩蛋白（pax‐illin）家族高度同源。人类ARA55基因定位在16 号染色体（chr16：31，471，585-31，477，960；GRCh38/hg38），共含11个外显子，ORF为1 386 bp，编码的蛋白多肽含有461个氨基酸，分子量为55 kD。本研究将pCMV-ARA55-EGFP 重组质粒转染到CNE2 细胞后，24 h 即可看到 EGFP 的表达，约 48 h 达到表达高峰，EGFP 的表达阳性率接近60%。因本研究插入的ARA55 全长cDNA 序列与EGFP 共用一个启动子，故重组质粒表达融合蛋白。本研究经Western blot 进一步确认转染细胞可表达融合蛋白（ARA55-EGFP），说明重组质粒可在CNE2 细胞中表达外源性ARA55蛋白。

目前，ARA55 在恶性肿瘤中发挥的生物学功能因肿瘤类型的不同而有差异。GULVADY 等［6］研究发现，ARA55 在癌细胞发生侵袭转移时的形态改变及可塑性调节等过程中发挥重要作用。有报道通过研究大肠癌的裸鼠种植瘤组织细胞和LoVo 大肠癌细胞的超微结构发现，ARA55 的表达在癌细胞的成熟及发展过程中发挥重要作用［11］。QIAN 等［4］发现，胰腺癌患者癌组织中高表达ARA55 蛋白，并且患者的预后受ARA55的表达峰度影响，蛋白表达越高，患者生存时间越短；当下调PCCs 胰腺癌细胞中ARA55 的表达时，可观察到细胞的生长增殖、侵袭和转移能力明显被抑制，细胞发生凋亡。同样，有研究报道ARA55 在小鼠B16-F1 黑色素瘤细胞中也呈高表达状态，当采用shRNA 沉默ARA55 表达后，细胞的生长增殖及侵袭迁移均受到不同程度的抑制［12］。在肝细胞癌中也发现，ARA55 的表达与肿瘤的进展密切相关［13］。因此，可推断ARA55在某些肿瘤中发挥癌基因的作用。

尽管如此，有些研究认为ARA55可能是发挥抑癌基因的作用。有研究显示ARA55 在大肠癌组织的表达较癌旁组织低［14］。另外，前列腺癌患者癌组织中ARA55的平均表达峰度远低于癌旁组织；其进一步分析发现，癌组织中ARA55 表达越低的患者，肿瘤的分化程度越高；此外一些培养的前列腺癌细胞系中也发现 ARA55 呈表达下调或沉默状态［3，15］。本研究在CNE2鼻咽癌细胞中上调外源性ARA55的表达后，发现CNE2 细胞的生长增殖和体外侵袭转移能力均被不同程度地抑制或阻碍，提示ARA55在鼻咽癌（CNE2 细胞）中发挥抗癌基因的生物学作用。国内有研究在大肠癌LoVo 细胞中上调外源性ARA55 后，也发现细胞发生凋亡［14］，本研究结果与之类似。

本研究进一步探讨了ARA55过表达对CEN2细胞凋亡的影响。因重组质粒转染的CNE2 细胞含有EGFP，本研究用红色荧光Annexin V-PE/7-AAD 双色染料检测细胞凋亡发生率［9］。本研究发现外源性ARA55 表达上调后，CNE2 细胞凋亡率明显升高。崔巍等［14］的研究也显示，在大肠癌细胞中上调ARA55 后，发生凋亡的细胞数量明显增加。细胞发生凋亡后，可产生片段化的DNA［16-18］。本研究提取转染72 h后的细胞基因组DNA，经电泳发现ARA55过表达组细胞基因组DNA 发生片段化明显。进一步检测凋亡相关蛋白的表达变化，发现上调ARA55表达后，CNE2 细胞中Bcl-2 蛋白表达下调，下游的Cytochrome C 蛋白的表达升高，Caspase-9 的剪接体及激活型Caspase-3（只检测Asp175 剪切后产生的19 kD 和17 kD 的剪接体）表达均明显升高。以上结果提示，ARA55 过表达可激活内源性线粒体凋亡通路诱导CNE2 细胞凋亡，结果与文献的报道基本一致［14］。

综上所述，上调CNE2 中ARA55 表达可抑制细胞的生长增殖和体外侵袭转移能力，并能够激活内源性线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡。