消痰化瘀利窍方对CIH大鼠心肌局部肾素-血管紧张素系统的影响

任静 李杰茹 郭亚净 杨胜昌 韩聚强 李文雅 赵洋 吉恩生

(河北中医学院 1中西医结合学院，河北 石家庄 050020；2生理教研室；3低氧生理与病理生理实验室)

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的主要危害是慢性间歇性低氧(CIH)造成心、脑、肾、血管等多脏器损害〔1〕。OSA诱发心脏病变是源于CIH引起的心肌组织代谢紊乱和结构异常。CIH是OSA患者易合并心血管病变如高血压、冠心病和心力衰竭的病理基础〔2〕。研究表明CIH引起的系统性炎症反应、氧化应激、交感神经兴奋性增加、内皮功能损伤等是OSA 并发心血管病变的主要机制〔3〕。心脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)在OSA诱发心脏病变的发生发展中发挥重要作用〔4〕。抑制局部 RAS 的激活，阻断 RAS 的作用可作为预防和治疗的OSA引发心脏病变重要环节。消痰化瘀利窍方(XHLR) 是针对于OSA的“痰湿、血瘀、气滞”等病机特点而创设的有效组方，多年的临床实践证明，该方对OSA患者具有较好的临床治疗效果。前期研究结果显示，XHLR可抑制 CIH 大鼠心肌纤维化和心肌肥大等病变〔5〕，提示XHLR对预防OSA继发心脏病变具有较好的效果。鉴于此，本研究基于心肌局部 RAS 探讨XHLR缓解 CIH 大鼠心肌病变的初步机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级的雄性SD大鼠，体重180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号:SCXK〔京〕2016-0006。

1.1.2药物 XHLR由丹参30 g、赤芍15 g、生黄芪15 g、茯苓15 g、枳壳15 g、法半夏12 g、炒白术12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、桔梗12 g、川芎12 g、地龙12 g、陈皮10 g、白芥子10 g组成。按以上组方比例由河北省神威药业集团有限公司购进各药材饮片。由本校中药化学教研室制备实验用药液。应用水煮醇沉制备工艺将以上中药饮片制备成生药含量为 2.5 g/ml的液体药剂。

1.1.3试剂 血管紧张素(Ang)Ⅱ及醛固酮酶联免疫试剂盒购于南京建成生物工程研究所；兔抗鼠c-jun抗体、兔抗鼠AngⅡ受体1(AT1R)抗体、兔抗鼠蛋白激酶(PK)C抗体及兔抗鼠Tublin单克隆抗体均购于武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CIH造模及分组 SD大鼠随机分为常氧(Normoxia)组、中药对照(Formula)组、CIH组、CIH+中药干预(Formula+CIH)组，每组8只。在动物实验室适应性饲养1 w后，进行CIH造模。动物CIH舱的制备流程，首先向舱内充入100%N2，时间持续1.5 min，使舱内O2浓度降至9%后，再向舱内充入医用纯氧1.5 min，使舱内O2浓度升至 21%，3 min为一循环。CIH组和Formula+CIH组的大鼠暴露于CIH舱，每天8 h(9∶00～17∶00)，持续3 w。此外，Formula+CIH组与 Formula组的大鼠在每次上舱前开始灌胃给药，XHLR药量25 g/(kg·d) (参照动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表计算动物用药剂量)，CIH组与Normoxia 组灌胃等体积蒸馏水，连续3 w。于造模3 w后，大鼠禁食12 h后，戊巴比妥钠(100 mg/kg)麻醉，颈总动脉采血后，开胸取出心脏，一部分心脏组织置于4%的多聚甲醛液中固定，备用于免疫组织化学染色，另一部分放入-80℃冰箱中保存，供Western印迹，q-PCR检测。

1.2.2免疫组织化学染色法检测心肌组织AT1R 表达 石蜡切片，常规脱蜡、水化、3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，5%～10%正常山羊血清封闭修复抗原后，滴加一抗(1∶100)工作液，4℃过夜。PBS 冲洗后，滴加适量生物素标记二抗工作液37℃孵育60 min，滴加适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，孵育30 min，PBS冲洗后，二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色。

1.2.3RAS相关指标 取左心室肌组织适量，制成匀浆液，4 000 r/min，4℃离心20 min，取上清液于-80℃冻存备用。按酶联免疫法测定匀浆液AngⅡ及醛固酮含量。

1.2.4心肌组织中血管紧张素转换酶(ACE) mRNA 及ACE2表达测定 取适量冻存的心肌组织，用Trizol试剂提取总RNA，用通用反转录试剂盒(M-MLV)逆转录酶(RR047A,TaKaRa，大连)将1 μg总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，所需反应溶液包含40 ng cDNA、目的基因特异性引物和2 X宝生物染料法荧光定量试剂盒(RR820A,TaKaRa，大连)。以 GAPDH 作为内参。根据以下参数见Table1进行反应：预变性95℃×5 min，变性 94℃×30 s，退火 60℃×30 s，延伸72℃×30 s，共 40 个循环。用荧光定量PCR(Bio-Rad，CFX Connection，Hercules，USA)检测PCR扩增。引物序列见表1。用ΔΔCt 值法，以 GAPDH 为内参定量目的基因(ACE、ACE2) mRNA表达量。

表1 PCR引物序列

1.2.5Western印迹检测蛋白表达 将适量心肌组织制成匀浆，以12 000 r/min的转速将所制匀浆在4℃温度下离心15 min后，取其上清，采用二喹啉甲酸(BCA)法测其蛋白浓度，制成蛋白样品。取适量蛋白上样，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转膜，5%脱脂牛奶封闭 1.5 h，TBST液洗涤3次，然后分别给予1∶1 000 稀释的兔抗大鼠PKC抗体、兔抗大鼠c-jun抗体，4℃冰箱孵育过夜;TBST冲洗，加入滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1.5 h，TBST 洗涤，电化学发光(ECL)显色，灰度扫描后，用 Quantity One 分析软件对蛋白电泳条带进行分析，以目标蛋白条带灰度/内参Tublin条带灰度值表示所测指标的蛋白表达。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1XHLR降低CIH大鼠心肌组织中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量 与Normoxia组比较，CIH组心肌组织中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明显升高，而与CIH组相比，CIH+Formula组 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明显降低，见表2。

表2 各组心肌组织 AngⅡ、醛固酮的含量

2.2各组ACE、ACE2 mRNA表达比较 与Normoxia组相比，CIH组心肌组织中ACE mRNA表达水平明显增多，ACE2 mRNA表达下降。与CIH组比较，CIH+Formula组心肌组织中ACE mRNA表达被抑制，ACE2 mRNA表达水平明显升高，见表3。

表3 Q-PCR法检测各组心肌组织 ACE和ACE2 mRNA表达

2.3XHLR抑制CIH大鼠心肌组织中PKC和c-jun蛋白的表达 与Normoxia组比较，CIH组心肌组织中PKC和c-jun蛋白表达水平升高，而与CIH组相比，CIH+Formula组心肌组织中PKC和c-jun蛋白表达水平明显下降。见图1、表4。

1～4：Normoxia组，CIH组，Formula+CIH组，Formula组图1 Western印迹法检测各组心肌组织 PKC和c-jun蛋白表达水平

表4 各组PKC、c-jun、AT1R表达比较

2.4XHLR降低CIH大鼠心肌组织中AT1R的表达 与Normoxia组比较，CIH组心肌组织中AT1R蛋白表达水平升高，与CIH组相比，CIH+Formula组心肌组织中AT1R蛋白表达明显下降。见表4、图2。

图2 各组心肌组织AT1R的表达情况(DAB，×400)

3 讨 论

OSA 的主要病理生理特征是夜间睡眠过程中反复发生的间歇性低氧(IH)，这种反复的低氧、复氧刺激机体的内分泌机制，并且激活循环中的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)〔6，7〕。循环中的RAAS,由肾脏的球旁细胞分泌的肾素进入循环血，降解肝脏分泌的血管紧张素原生成AngⅠ,AngⅠ再在ACE的作用下生成AngⅡ。AngⅡ引起血管收缩、刺激醛固酮产生、促使水钠潴留、促进血管平滑肌细胞增生等效应，使血压升高〔8〕。IH可以通过激活循环RAAS诱导高血压的发生〔9〕。CIH可以刺激颈动脉体的化学感受器，从而激活全身交感神经系统和RAS〔10〕。将大鼠暴露于低氧环境中7 d 后，监测到其 ACE、AngⅡ与 AT1R水平较正常对照组显著增加〔11〕。并且近年来研究发现CIH也可激活心脏局部RAS进而促进心血管病变的发展〔4〕。作为RAS关键酶的ACE，通过多种分泌方式参与RAS的全身和局部作用。AngⅡ是ACE的产物，ACE可通过产生AngⅡ损伤心血管系统〔12〕。本研究提示XHLR通过抑制CIH诱导ACE基因的表达，使Ang Ⅱ和醛固酮生成减少，以减缓轻心肌病变的发生。

ACE2作为RAS的一个新成员，可以抑制RAS，并具有血管舒张和抗增殖功能〔13〕。ACE2 是一种专一的单羧基肽酶，可以将AngⅠ降解为Ang(1～9)，同时可将Ang Ⅱ降解为Ang(1～7)，但ACE2分解Ang Ⅱ的速率远高于其分解AngⅠ〔14〕。因此，激活 ACE2活性，是降低 AngⅡ的重要途径之一，可有效地降低血压〔15〕。本研究发现，CIH模型大鼠心肌组织ACE2 基因表达明显降低。XHLR可使心肌ACE2 mRNA表达水平升高，减缓心肌病变的发生。

AngⅡ 作为 RAS的重要成员之一，与受体结合后发挥其生理与病理作用，一般认为其受体主要有 AT1R和AT2R两种,AngⅡ与AT1R结合产生收缩血管及促进炎症发生等作用〔16〕，还可增加氧化应激、凋亡和心脏重构，最终导致心力衰竭〔17〕。本研究提示XHLR可减弱CIH诱导的AngⅡ生成，降低AT1R的表达。

RAS在心血管系统病变中扮演的重要的角色，心肌组织中的AngⅡ 通过自分泌和(或)旁分泌机制作用于AT1R，经G蛋白耦联作用，激活磷脂酰肌醇特异性磷酸酯酶C，引起心肌细胞膜外钙离子跨膜内流和胞质内钙离子贮存池释放增加，并诱导激活PKC，进而引发即刻早期反应基因c-jun的表达，增加蛋白质合成，激发心肌肥大、间质纤维组织增生〔18〕。本研究提示XHLR可通过降低心内RAS活性进而阻断PKC/c-jun通路改善CIH大鼠的心脏功能。