马驽巴贝斯虫ddPCR检测方法的建立

陈少博，杨 帆，荆文魁，王伊琴，康晓平，常 鸿，聂芝君

（1.二连海关技术中心，二连浩特 011100；2.军事科学院 军事医学研究院微生物流行病研究所，北京 010071）

马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫引起的一种血液原虫病，由蜱作为中间宿主而传播。该病在世界范围内广泛流行，在我国大部分省份均有发生[1-2]，给马产业的发展带来了重大的经济损失。患病动物以高热、贫血、黄疸、心肺机能障碍为主要症状[3]，严重时可导致动物死亡。该病的发生与媒介蜱的地理分布及活跃季节密切相关，具有一定的地区性和季节性[4]。目前，对于马驽巴贝斯虫主要的检测手段有血涂片法、血清学方法、PCR方法等[5-6]。

微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）的理论模型早在1992年就由Sykes等[7]首先提出，该学者把有限稀释法和泊松分布统计学原理结合起来，旨在用于对核酸的定量检测。后来经过Vogelstein等[8]在试验当中的成功应用，理论体系逐渐完善。该学者把稀释后的DNA模板分配到若干独立的反应单元中，使得每个反应单元有或无模板DNA，反应后通过采集荧光信号，确定阳性反应单元的数目，通过泊松分布原理对目标模板进行计数。但是当时自动化程度较低，手动操作复杂；独立反应单元较少等因素，导致准确率较低，该方法一直难以普及应用。在过去的10年中，随着自动化仪器的诞生，ddPCR的发展和应用得到了飞速的发展，目前，该技术已经应用于传染病病原的检测[9-10]，食品中动物源性成分及微生物的定量检测[11-12]，甚至产前诊断[13]等一系列相关领域中。但是，利用ddPCR方法对马驽巴贝斯虫进行检测的方法尚未检索到。因此，本研究建立了一种检测马驽巴贝斯虫病的ddPCR检测方法，为该病的诊断及检测提供新的方法及技术储备。

1 材料与方法

1.1 样本来源和主要试剂 二连海关技术中心保存的30份马血样品，及本实验室制备的马驽巴贝斯虫标准质粒。ddPCR检测试剂购自美国伯乐公司；荧光定量PCR检测试剂购自TaKaRa公司，引物探针由生工生物工程（上海）公司合成。

1.2 引物及探针来源 根据前期研究成果合成马驽巴贝斯虫Bc48基因引物和探针[6]。BBS-F：5'-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3'，BBS-R：5'-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3'，BBS-P：5'-FAM-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTGTAMRA-3'。

1.3 ddPCR体系和条件的优化 ddPCR反应体系体系组成为：2×Supermix for Probes预混液10 μL，引物浓度分别选择0.25、0.5、0.75、1 μmol/L，探针浓度分别选取0.25、0.5、0.75、1 μmol/L，采用矩阵法对体系中引物及探针浓度进行优化，模板2 μL，用ddH2O补足至20 μL。扩增条件为：95℃预变性10 min；94℃变性30 s，50℃～60℃延伸1 min，共40个循环；98℃固化微滴10 min。升降温速率2℃/s，利用梯度PCR仪进行扩增。

1.4 ddPCR特异性试验 分别以马驽巴贝斯虫、马巴贝斯虫、环形泰勒虫和健康马血的DNA为模板，进行ddPCR试验，评价方法的特异性。

1.5 ddPCR重复性试验 选取7个不同浓度的阳性标准品进行重复性试验，每个浓度设立3个平行进行检测，根据扩增反应后检测的定量数值，计算变异系数（CV），评价试验的稳定性。

1.6 ddPCR灵敏性试验 用一定浓度的马驽巴贝斯虫阳性质粒为模板，对该阳性质粒依次进行10倍梯度稀释，对稀释后的样品进行ddPCR扩增，检测反应的灵敏性。

1.7 ddPCR方法对未知样品的检测应用 用建立好的ddPCR方法对30份疑似感染马驽巴贝斯虫血液样品进行检测，检验该方法在实际应用中的效果。

2 结果与讨论

2.1 ddPCR体系及扩增条件

2.1.1 ddPCR体系优化 采用矩阵法对体系中引物及探针浓度进行优化，部分引物探针浓度下的ddPCR。结果显示，引物浓度对体系中阳性微滴的信号值强度影响不明显，但是随着探针浓度的升高，体系中阳性微滴的信号值也随之升高，分布范围更广泛，微滴数不集中（图1），因此，综合考虑，选取引物浓度为0.75 μmol/L，探针浓度为0.25 μmol/L，为该方法的最佳体系浓度。

图1 不同引物及探针浓度体系下ddPCR扩增结果Fig.1 The ddPCR result at different concentrations of primers and probe

2.1.2 ddPCR扩增条件的优化 PCR扩增过程中，退火温度的选择是极为关键的，因此，本文选择50℃～60℃不同的温度梯度对模板质粒进行ddPCR扩增。结果显示，退火温度在60℃时，几乎没有阳性微滴数出现，随着退火温度降低，阳性微滴数逐渐增多，后又减少。在温度范围为52.0℃～56.3℃，阳性微滴数基本相同，而且阴、阳微滴分层较为明显，但是，退火温度较低时，容易造成非特异性扩增（图2），所以，在保证反应正常进行的前提下，选择较高温度56℃为该方法的退火温度。

图2 不同退火温度下ddPCR扩增结果Fig.2 The ddPCR result at different annealing temperatures

2.2 ddPCR特异性试验结果 ddPCR特异性试验结果显示，马驽巴贝斯虫有阳性微滴出现，而马巴贝斯虫、环形泰勒虫和健康马血DNA均无阳性微滴（图3），说明所建立的ddPCR方法对马驽巴贝斯虫有良好的特异性。

图3 ddPCR特异性试验Fig.3 Specificity test of ddPCR

2.3 ddPCR重复性试验结果 选取7组不同浓度的阳性标准品进行重复性试验，每组浓度3个平行样品，结果见表1。前6个浓度对应的质粒拷贝数间变异系数较小，在一定浓度范围内，变异系数随着拷贝数减少而增大，当拷贝数小于1 copies/μL时，变异系数为25.00，超出了可接受范围。表明所建立的方法在定量检测1 copies/μL以上浓度的样品时具有较好的稳定性。

表1 ddPCR重复性试验Table1 The reproducibility test of ddPCR

2.4 ddPCR灵敏性试验结果 用已知的马驽巴贝斯虫阳性质粒为模板，对该阳性质粒依次进行10倍梯度稀释，对稀释后的样品进行ddPCR扩增，检测反应的灵敏性。结果显示，当质粒原液被稀释到10-4～10-8时，显示平均样品浓度分别为3335、399、36.5、3.3、0.235 copies/μL，图4为灵敏性试验扩增结果。5个稀释梯度下定量拷贝数相关系数为0.9986，表示线性关系良好，如图5所示。结合表1中的稳定性试验，当阳性质粒小于1 copies/μL时，变异系数为25.00，定量数值不稳定，超出了可接受范围，故本文中的最低定量检测限设为3.3 copies/μL。但是定性检测限可以达到小于1 copies/μL。这对于极其微量的病原体，无论定量还是定性检测，都有较好的灵敏性。在同类研究中，原霖等[14]建立了非洲猪瘟的ddPCR检测方法，方法的灵敏度达到了0.8 copies/μL；石磊等[15]建立了猪圆环病毒3型ddPCR检测方法，灵敏度达到了4.4 copies/μL。总之，利用ddPCR方法对病原体检测时，方法灵敏度基本上都可以达到个位拷贝数。

图4 灵敏性试验扩增结果Fig.4 The result of sensitivity assay

图5 不同稀释度下拷贝数线性关系Fig.5 The linear relationship of copies for different dilutability

2.5 应用ddPCR方法对未知样品的检测 用建立的ddPCR方法对30份疑似感染马驽巴贝斯虫的血液样品进行检测，结果表明，检出的阳性样品数为19份。因此，马驽巴贝斯虫感染阳性率为63.33%（19/30）。所有感染样品中，感染病原数量均较少，其中最大拷贝数为7.3 copies/μL，最小仅为0.18 copies/μL。说明这些马匹可能处于慢性感染期，或感染耐过后处于长期带虫的阶段。对样品的检测，进一步验证了ddPCR方法对于检测微量病原体的较大优势。

ddPCR技术因其灵敏度高、定量相对准确等优点而得到了相关学者的广泛关注。但是其昂贵的仪器及试剂耗材是限制该技术普及的重要因素。与PCR、qPCR相比，该技术检测费用偏高，操作相对复杂，因其繁琐的操作步骤，很容易出现污染，造成阴性样品也检出拷贝数值的情况。所以，在ddPCR检测过程中，要谨慎操作，严格避免污染。在实际工作中，结合各种PCR方法的优缺点，合理选择样品需要的检测技术，对于实际检验检疫具有重要意义。