基于肠-乳腺轴浅谈奶牛“内源性乳腺炎”的病理机制及防控措施

胡晓宇，赵才军，曹永国，付云贺，张乃生 (吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

奶业在国家的社会、经济中占有重要地位，其发展已成为评价一个国家畜牧业发达程度的重要标志。乳腺炎是奶牛最常见的多发病，是公认的危害奶业生产的头号疾病。该病病因复杂，致病途径及发病机制尚未完全阐明，且防制困难，单纯靶向乳腺局部治疗效果有限。通常认为，乳腺炎主要是细菌等病原通过乳头进入乳腺引起的局部炎症反应。但笔者通过在生产实践中对奶牛乳腺炎发病规律的观察、文献报道的梳理以及课题组最新研究成果的总结，发现乳腺炎的发生，除相对于外界病原感染引起的外源性致病途径外，尚存在内源性致病途径，创新性的提出“内源性乳腺炎”这一病理概念。基于此，相对于依据病原学、病理学和症状学等分类方式，本研究提出乳腺炎新的病因学分类方式，即基于致病途径将乳腺炎分为外源性乳腺炎和内源性乳腺炎。乳腺炎这一新的病理学概念的阐明和分类方式的建立，不仅为乳腺炎的致病途径和发病机制做出重要的创新性解读，改变对诱发乳腺炎的病原均来自于外界环境的传统认知；同时，提示选用具有调控瘤胃内环境及菌群的制剂，靶向肠-乳腺轴，可能是防制“内源性乳腺炎”的有效方法和途径。

1 “内源性乳腺炎”病理概念的提出——乳腺炎的发生除与外界病原感染有关外，尚存在内源性致病途径

乳腺炎泛指乳腺组织的各类炎症，其主要特点是乳汁发生理化性质及细菌学变化，乳腺组织发生病理学变化。乳腺炎病因复杂，与饲养管理、环境卫生、产后机体与乳房状态、遗传特性、挤奶不当等多种因素有关，目前认为最为关键的还是病原微生物的感染。根据病原微生物、病理变化、临床症状和病程长短等，现有多种不同的分类方法。我国目前主要采用美国国家乳房炎委员会(NMC)根据乳房及乳汁中有无肉眼可见的变化，将乳房炎分为隐性乳房炎[乳房和乳汁均无眼观变化，但乳汁体细胞数(SCC)升高]和临床型乳房炎(乳汁和乳房均有眼观变化)的分类方法。课题组前期调查发现，有些奶牛特别是高产奶牛的乳腺炎，临床症状不明显，仅表现出SCC升高，也分离不到常见致病菌，且多伴发或继发于前胃驰缓和亚急性瘤胃酸中毒(SARA)等消化系统性疾病。同时，在临床实践中针对乳腺的局部治疗效果有限。又有《医宗金鉴》所示：“乳痈由肝气郁结、胃热壅滞而成”，即反刍动物因食精料过多，致使胃热壅盛，气血凝滞，遂成乳痈。更有现代医学之父希波克拉底提出“一切疾病始于肠道(all disease begins in the gut)”和传统中医文化提出“欲得长生，肠中常清，粪毒入血，百病蜂起”的理论，提示高精饲料应激等因素导致奶牛胃肠道稳态失衡，可能是乳腺炎的重要内源性诱因。

瘤胃是反刍动物特有的消化器官，相当于人和单胃动物的大肠，定殖着种类繁多，数量庞大的微生物群落，大多数重要的物理和生化过程都在瘤胃中且在微生物的参与下完成。越来越多的研究发现，肠道菌群不仅对胃肠道健康至关重要，还参与代谢性、自身免疫性和感染性等众多疾病的发生发展过程[1-3]。研究表明，在健康和患乳腺炎奶牛的瘤胃菌群结构和功能之间存在显著性差异[4]。并且给奶牛长期饲喂高精料，可导致乳汁中SCC增加[5]，而添加菊粉可以通过改善奶牛瘤胃微生物及其代谢物结构缓解隐性乳腺炎[6]。此外，近年来临床实践上通过服用益生菌来治疗乳腺炎，也取得了良好效果[7]。提示瘤胃菌群与乳腺2个看似毫无关系的器官，可能存在密切联系。本课题组前期研究发现，通过给小鼠饮水中添加抗生素扰乱肠道菌群，在没有外界病原菌感染的情况下，可导致血乳屏障渗透性增加和乳腺炎的发生[8]。并且将患乳腺炎奶牛的粪便和瘤胃液移植给小鼠，可直接导致小鼠乳腺炎(部分结果尚未发表)[9]。证明瘤胃菌群紊乱与乳腺炎直接关联。另有研究发现，长期饲喂高精料可导致奶牛瘤胃源内毒素(LPS)通过血液进入乳腺，影响乳腺的氧化应激和乳蛋白生成[10]。本课题组前期同样发现，对奶牛饲喂高精料诱导SARA模型导致SCC升高的同时，瘤胃内丰度升高的致病菌和LPS等代谢产物大量出现于乳腺[11]。提示瘤胃菌群紊乱可通过促进瘤胃内有害菌及其代谢产物迁移至乳腺，诱发乳腺炎。

以上临床和试验中的发现表明，乳腺炎的发生，除与已知的外界病原微生物感染等因素介导的外源性致病途径外，尚存在由瘤胃菌群及其代谢物介导的内源性致病途径，因而推导出“内源性乳腺炎”病理概念，即相对于外界病原感染乳腺导致的局部炎症反应，在非外界病原感染情况下，由于饲料改变等应激因素，导致胃肠道菌群紊乱，黏膜屏障渗透性增加，胃肠道内致病菌及其代谢产物通过内源性途径迁移至乳腺，致使乳汁中SCC升高，致发乳腺炎(图1)。

图1 奶牛“内源性乳腺炎”病理假说

2 “内源性乳腺炎”病理机制的解析——肠-乳腺轴介导途径

肠道菌群对肠外远端器官的调节是近年来国内外研究的热点、难点和新兴领域。随着肠-脑轴、肠-肺轴和肠-肝轴等的提出与解析，发现肠道菌群紊乱可导致肠道内有害菌及其代谢产物以内源性途径迁移至脑、肺脏、肝脏等肠外远端器官，引发相关疾病。近年来，随着肠-乳腺轴的提出，更是将肠道与乳腺2个看似不相关的器官联系在一起，虽然肠-乳腺轴的介导途径尚不清晰，但在借鉴相关研究报道和本课题组前期研究结果的基础上，推测肠-乳腺轴主要是通过瘤胃源性细菌和/代谢产物和/神经递质和/免疫细胞4种途径介导和调控乳腺炎的发生发展。

(1)瘤胃细菌迁移：通常认为乳汁菌群来源于胎儿口腔或皮肤、乳腺皮肤、或环境中的细菌，但最近有研究提出肠道中的细菌可以通过血液或淋巴循环途径迁移至乳腺(图2)[12]。研究表明，哺乳母亲体内存在含有吞噬细菌的循环淋巴样细胞，并且在哺乳期的母乳中可以检测到肠道细菌存在[13]。并且，怀孕和哺乳期小鼠肠道细菌从肠道迁移至乳腺的频率增加[14]。此外，免疫细胞，特别是树突状细胞(dendritic cell,DCs)可以保留活的肠道细菌数天，并通过淋巴循环将它们带到肠系膜淋巴结，随后迁移到远端器官，包括哺乳期的乳腺[15-16]。

图2 肠道细菌迁移至乳腺途径[12]

对于奶牛等反刍动物而言，瘤胃细菌从瘤胃迁移至乳腺的途径可能同样存在(图3)[17]。YOUNG等[18]对收集的同一头健康奶牛的乳汁、血液和粪便样本菌群分析发现，三者均存在瘤胃球菌属(Rumi-nococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)，推测奶牛肠道细菌可能通过内源性途径迁移到泌乳的乳腺。此外，一项对牛的左氏原壁菌(Protothecazopfii,P.zopfii)性乳腺炎的流行病学研究表明，P.zopfii诱导的乳腺炎可能是由于该菌从肠道迁移至乳腺所致[19]。另有研究表明，子宫病原体可以通过血液从奶牛的肠道转移到子宫[20]。本课题组最近的研究同样表明，高精料诱导奶牛SARA模型导致瘤胃内乳腺炎致病菌寡养单胞菌(Stenotrophomonas)的丰度显著升高，并且该菌大量出现于乳腺[21]，进一步研究发现将荧光标记的寡养单胞菌灌服给小鼠，导致小鼠肠屏障和血乳屏障渗透性增加，且在血液以及乳腺组织中检测到带有荧光标签的该细菌，提示瘤胃内寡养单胞菌可以通过内源性途径迁移至泌乳的乳腺，诱发乳腺炎(结果尚未发表)。

图3 反刍动物体内的肠-乳腺[17]

(2)瘤胃源细菌代谢物迁移：肝脏是机体重要的解毒器官。一旦瘤胃内致病菌和有害代谢物进入血液且超过了肝脏的解毒能力，就会造成过多的炎性介质循环于血液中，导致机体发生系统性低度炎症反应[22]。当奶牛泌乳时，由于乳腺血流量增加，会导致炎症介质进入乳腺，破坏血乳屏障，诱发乳腺炎。研究表明，奶牛长期饲喂高精料会导致瘤胃内LPS大量释放入血，诱导机体发生系统性慢性炎症，同时激活乳腺钙贮运通道，诱导乳腺组织出现内质网应激、细胞凋亡和炎症反应[23]。并且LPS可以随着血液循环进入泌乳的乳腺，影响乳腺的氧化应激状态和乳蛋白合成[5,10]。本课题组前期研究同样发现，高精料诱导SARA模型的奶牛瘤胃内释放的LPS导致瘤胃屏障渗透性增加，进而入血，损害肝功能，从而循环至乳腺，破坏血乳屏障，诱发乳腺炎(图4)[21,24]。此外，合成乳成分的主要原料短链脂肪酸(SCFAs)主要来源于瘤胃微生物对奶牛摄入的碳水化合物发酵而产生的生理过程表明，瘤胃内SCFAs可以通过内源性途径迁移至乳腺。此外，SCFAs还是调节血乳屏障的重要物质，本课题组前期研究发现给小鼠灌服产丁酸的益生菌能够通过代谢的丁酸进入乳腺，维持血乳屏障的完整性，从而抑制金葡菌感染诱导的乳腺炎[8]。

图4 瘤胃源LPS进入泌乳乳腺，破坏血乳屏障，诱发乳腺炎[21,24]

(3)瘤胃源性神经递质：乳腺除了受感觉神经调节外，还受ENS和ANS的调控。研究表明，交感神经兴奋释放的去甲肾上腺素(NE)通过调节紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达，增加肠屏障渗透性[25-26]。此外，神经递质儿茶酚胺(catecholamine)和乙酰胆碱(acetyl choline，ACH)均能调节肠黏膜通透性[27]。芍药苷可以通过刺激ACH释放减轻大鼠功能性消化不良，同时增加肠屏障紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达[28]，并且活化α7烟碱乙酰胆碱受体显著缓解了心肺转流术诱导的肠屏障渗透性的增加[29]。此外，组胺可以通过影响ZO-1和钙黏蛋白(P-cadherin)的表达调节肾小球的滤过功能[30]。而影响肠屏障的NE、ACH、catecholamine以及组胺等神经递质均可以由肠道菌群产生[27]。血乳屏障的结构与血脑屏障和肠屏障及其相似，均是由上皮细胞间的紧密连接蛋白组成(图5)[31]。据此，肠道菌群代谢产生的调控肠屏障的神经递质同样对血乳屏障的通透性具有调节作用，而血乳屏障渗透性的增加，则是导致乳腺炎易感性增加的重要因素。此外，研究还发现，肠道细菌能够刺激肠内分泌细胞(enteroendocrine cell，ECs)分泌血清素(serotonin，5-HT)[32]。5-HT除了调节血压之外，还可以通过血液循环进入乳腺，影响乳腺健康[33]。更有研究表明，循环系统中高浓度的5-HT与血乳屏障渗透性增加和乳汁中SCC升高密切相关[34]。

图5 血乳屏障结构[31]

(4)瘤胃源性免疫细胞迁移：免疫细胞是机体内一类多样化的细胞群，其中一部分免疫细胞会在血液中循环并在接收到来自组织损伤的信号后迁移到患处，而其他免疫细胞则会驻留在组织中并捕获入侵的微生物，随后迁移到淋巴结激活宿主的免疫反应。免疫细胞迁移到肠受肠道菌群以及肠道菌群参与介导的细胞因子、趋化因子和神经递质的调控[35]。研究发现，肠道菌群可以通过刺激2型固有淋巴细胞(ILC2s)从肠道迁移至肺脏调节肺脏炎症反应，而抗生素扰乱肠道菌群则会影响肺脏和肠道中ILC2s的数量和迁移[36]。也有研究证明，肠道菌群可以通过促进3型固有淋巴细胞(ILC3s)进入新生小鼠的肺脏缓解肺炎[37]。FITZPARICK等[38]还发现肠道菌群可以通过促进表达IgA的浆细胞迁移至大脑，调节脑部炎症反应。也有研究提出肠黏膜固有层的一些免疫细胞可以迁移到乳腺[39]。此外，RAMANAN等[40]发现，在怀孕后期，母体肠道菌群可调控表达IgA的浆细胞产生并迁移至乳腺，进而促进子代肠道RORγ+Treg细胞的发育，有助于新生儿抵抗肠道炎症。

3 “内源性乳腺炎”防制的探索——靶向肠-乳腺轴调控瘤胃内环境及菌群

如果瘤胃菌群紊乱是经由肠-乳腺轴来介导调控“内源性乳腺炎”的发生发展过程，那么靶向瘤胃内环境及菌群的稳态调控可能就是防制“内源性乳腺炎”的有效途径和方法。益生菌在奶牛乳腺炎的防制应用中取得了很大的进展。通过对乳腺炎患者服用发酵乳杆菌 CECT5713或唾液乳杆菌CECT5714可显著降低乳汁中细菌总数以及疼痛感和复发率[41]。此外，一项为期16周的临床试验表明，在哺乳期服用发酵乳杆菌CECT5716比未服用该益生菌的女性乳腺炎发病率下降51%[42]。在反刍动物研究中同样发现，肠道中乳腺炎致病菌丰度的增加和乳酸菌等益生菌丰度的降低与奶牛乳腺炎有关[43]。另有临床试验研究发现，添加酵母和乳酸菌能够显著降低患隐性乳腺炎山羊乳汁中SCC和炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度，同时降低乳汁中肠球菌(Enterococcus)和链球菌(Streptococcus)等乳腺炎致病菌的丰度[44]。最近又有研究发现添加益生元菊粉，可以通过改善奶牛瘤胃菌群及其代谢产物缓解隐性乳腺炎并改善乳品质[6]，以及添加解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens-9)可以通过改变肠道菌群缓解山羊的隐性乳腺炎[45]。粪菌移植近年来被认为是治疗肠道菌群紊乱诱发相关疾病的有效途径。研究发现，瘤胃菌群移植能显著缓解奶牛SARA[46]，此外，通过粪便移植同样能显著改善犊牛腹泻[47]。本研究前期研究发现，对肠道菌群紊乱诱发乳腺炎的小鼠移植健康小鼠的粪便，能够显著改善因肠道菌群紊乱所诱导的乳腺炎症[8]。

4 结论

综上所述，乳腺炎的发生，相对于已知的外界病原感染等因素介导的外源性致病途径外，尚存在由瘤胃菌群及其代谢物介导的内源性致病途径，由此产生“内源性乳腺炎”病理概念，即针对饲料变更等应激因素导致奶牛瘤胃内环境失衡，瘤胃菌群紊乱，有益菌及其代谢产物减少，而有害菌及其代谢产物增多，同时瘤胃菌群代谢的神经递质紊乱，这些有害菌及其代谢物一方面影响瘤胃内免疫细胞向乳腺迁移；另一方面通过破坏瘤胃上皮细胞的紧密连接蛋白表达，引起胃肠道屏障通透性增加，促使有害菌及代谢物进入血液，引起机体“系统性慢性低度炎症”，当奶牛发生泌乳应激时，伴随着循环旺盛的乳腺血液和淋巴液，瘤胃内有害菌及其代谢产物以内源性途径进入乳腺，破坏血乳屏障，引起“内源性乳腺炎”。基于“内源性乳腺炎”的定义，本课题组提出针对于致病途径将乳腺炎分为外源性乳腺炎和内源性乳腺炎，丰富乳腺炎的病因学和病理学理论。并且建议开辟通过靶向瘤胃菌群调节“肠-乳腺轴”防制乳腺炎新的途径和方法。以期为深入认识和破解乳腺炎发病机制与防制难题提供新的理论与临床指导，拓展科学前沿。