右归丸辅助骨髓间充质干细胞对家兔骨质疏松性骨折愈合的影响及机制初探

朱俊 姚帅辉 郭小磊

郑州人民医院骨一科，郑州 450003

随着人口老龄化，骨质疏松性骨折的患病率预计将大幅增加。骨重塑过程是成骨细胞形成新骨与破骨细胞吸收骨基质之间的生理平衡［1］。骨愈合过程是一个复杂的生理过程，涉及骨组织再生和骨重塑。影响骨折愈合和重塑的因素有多种，如患有骨质疏松症的老年患者、绝经后激素水平发生变化、成骨细胞增殖减少；这使骨折后骨的愈合过程更加困难和缓慢，导致复杂的临床问题，如骨折延迟愈合、骨折不愈合，甚至术后骨折。骨折修复是一个极其复杂的生理过程，涉及多种细胞，包括骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）、骨祖细胞、成骨细胞（源自骨折的关键功能细胞）和破骨细胞。BMMSCs 负责成人骨骼的新陈代谢和骨折愈合。BMMSCs 是首先在骨髓中发现的具有多向分化潜能的干细胞，可在体外分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等功能细胞［2］。骨折后，BMMSCs 可快速迁移至骨折部位，然后开始增殖和成骨分化［3-4］。BMMSCs的成骨分化受到多种激素和局部因素的调节；因此，刺激其成骨分化被认为是加速骨折愈合的重要机制。中医理论认为，脾肾亏虚是骨质疏松性骨折的重要原因；也就是说，筋膜和骨骼营养的丧失是肾虚的主要发病机制［5-6］。此外，在“肾主骨”的理论下，可以通过右归丸来治疗；右归丸在促进骨形成、抑制骨吸收、调节骨重塑平衡、促进性激素分泌、抑制氧化应激、调节钙磷代谢等方面发挥着重要作用［7-8］。Janus 蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信号通路在细胞增殖和分化等多个过程中发挥着至关重要的作用。JAK2/STAT3 信号通路可以调节成骨细胞和骨组织再生的功能并促进血管生成，同时调节前破骨细胞的分化和迁移［9-10］。2023 年1 月至6 月，本研究探讨JAK2/STAT3 信号通路在右归丸辅助BMMSCs 对家兔骨质疏松性骨折愈合的作用及其对骨折修复的影响，为骨质疏松性骨折修复的相关研究提供理论依据，并为临床提供潜在的治疗方案。

资料与方法

1.主要试剂与仪器

右归丸（北京同仁堂），赛拉嗪、氯胺酮（北京碧云天生物科技），磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基（美国sigma 生物科技），多聚甲醛、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲苯、苏木精-曙红（HE）溶液（中国Solarbio Science Technology），TRIzol®试剂（Invitrogen；美国Thermo Fisher Scientific），TIANGEN 试剂盒（中国Tiangen Biotech），SYBR-Green 试剂（德国Lifeint），二辛可宁酸蛋白测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、聚偏氟乙烯膜（美国EMD Millipore），JAK2、STAT3、甘 油 醛-3-磷 酸 脱 氢 酶（GAPDH）一抗（美国信号通讯科技），辣根过氧化物酶标记的二抗（美国赛默飞世），电化学发光试剂（中国碧云天生物科技）。

Dexa 双能X 线吸收骨密度仪（德国Lunar DPXIQ），Inveon PET-SPECT.CT 仪扫描（德国西门子），Endura TELELF 3200 机械测试仪（美国Bose Corporation），DP73 显微镜（日本奥林巴斯），Mx3000P 快速实时聚合酶链式反应系统（德国Agilent Technologies，Inc）。

2.动物

郑州大学实验动物中心购买家兔50 只，雌雄各半［质量证明：SCXK（豫）2020-0008］。所有家兔喂食标准饲料，自由饮水，并保持在适当的温度（25±1）°C 下，湿度为70%，并进行12 h 的明暗循环。本研究符合《实验动物的护理和使用指南》，经郑州人民医院动物实验伦理委员会批准。

3.模型制备及骨髓间充质干细胞的分离培养

选取40 只家兔制备骨质疏松性骨折模型。对家兔进行左股骨中段截骨和外固定。使用赛拉嗪（2.5 mg/kg）和氯胺酮（22 mg/kg）进行麻醉并用异氟醚维持。将动物置于右侧卧位，左侧骨盆和肢体准备手术。在股骨干处做一1 cm长的颅侧切口，钝性解剖分离颅骨股骨肌和腓肠肌，暴露股骨，用微型固定器固定。将股骨外侧骨膜纵向切开，用锯进行横向截骨，并用无菌生理盐水持续冲洗。随后，将4 根直径为1.6 mm 的针引入股骨干中外侧，用2 根近端针和远端股骨截骨针固定骨折部位。最后，将固定器固定到销钉中以进行常规肌肉和皮下闭合。术前和术后3 d 皮下注射预防剂量的恩诺沙星（5 mg/kg）。

无菌条件下取出家兔胫骨，用PBS 清洗，锯掉骨端，用注射器用含10% FBS 和1%双抗的DMEM 冲洗骨腔。收获细胞悬液，4 ℃、1 050×g离心5 min，加入适量含10% FBS 和1%双抗的DMEM 重悬沉淀。计数后，将细胞以1×105个/ml的密度接种到100 mm 培养皿中，并在含有5% CO2的培养箱中37 °C 培养。每隔1 d 更换1 次培养基，直至覆盖培养皿底部的90%。将所得细胞用PBS 洗涤2 次，用0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3密度传代培养。

4.动物分组与给药方法

将成功建模的家兔随机分为模型对照组、右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组，每组10 只。右归丸组灌胃给药剂量为3.2 g/（kg·d），灌胃体积为10 ml/kg（每天1 次）。骨髓间充质干细胞组尾静脉注射1×106个/ml BMMSCs 液3 ml（每周1 次）。联合治疗组右归丸灌胃，给药剂量为3.2 g/（kg·d），灌胃体积为10 ml/kg（每天1 次）；尾静脉注射1×106个/ml BMMSCs 液3 ml（每周1 次）。上述各组均持续给予16周。另取10只家兔为正常对照组，正常对照组和模型对照组均给予等体积生理盐水灌胃。

5.观察指标及检测方法

16周后处死家兔，同时分离双侧后肢股骨组织，冷冻于液氮中，用于病理学检测及JAK2、STAT3 基因及蛋白的检测。

5.1.家兔股骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度测定 通过双能X 线吸收骨密度仪（Dexa）测股骨的BMD。Micro-CT 分析骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度；将大鼠股骨置于70%乙醇中，西门子Inveon PET-SPECT.CT 仪扫描远端股骨松质骨，能量设置为500 mA 和80 kV，分析骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

5.2.家兔股骨生物力学性能指标测定 使用Endura TELELF 3200 机械测试仪将垂直载荷施加到股骨的左中轴和左股骨头的顶部。将机械负荷速度保持在5 mm/min 的恒定位移速度下，直到股骨中轴和股骨颈均断裂为止。记录断裂负荷。指标包括弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力。

5.3.组织形态观察 将股骨近端样品在4%多聚甲醛中固定48 h，并用EDTA 脱钙30 d，然后将样品包埋在石蜡中。将石蜡块切成5 mm 厚的切片，并进行组织学检查。在二甲苯中脱蜡并在一系列乙醇中水合后，用HE溶液对股骨组织切片进行染色，并在光学显微镜下观察。

5.4.家兔股骨组织JAK2、STAT3 基因水平检测 股骨组织在液氮中研磨成粉末，使用TRIzol®试剂提取总RNA。根据制造商的方案，使用TIANGEN 试剂盒将10 μl 总RNA提取物制得cDNA 模板。使用SYBR-Green 试剂（Lifeint）在Mx3000P 快速实时聚合酶链式反应系统上进行实时荧光定量聚合酶链式反应。使用的热循环条件：95 °C，3 min；95 °C 12 s；62 °C 40 s 的40 个循环。使用的引物序列：JAK2 正向 5’-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’，反 向 5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’ ； STAT3 正 向 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ ， 反 向 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH 正 向 5’-TCGAGCGGACGCGTAGCTAGCTGCTA-3’，反 向 5’-TGGTCGTAGCTAGCTAGCTAGCTGATC-3’。 以GAPDH作为内部参照，并采用2-ΔΔCt方法根据以下公式计算目标基因的相对表达：ΔΔCt=［Ct（目标基因）-Ct（参考基因）］实验组-［Ct（靶基因）-Ct（参考基因）］为正常对照组。实验重复3次。

5.5.家兔股骨组织JAK2、STAT3 蛋白水平检测 家兔股骨组织预先通过液氮碾磨成粉末，加入适量含蛋白酶抑制剂的组织裂解缓冲液，4 ℃裂解过夜，4 ℃、11 500 g 离心10 min 以提取总蛋白，通过二辛可宁酸蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，并通过8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转移到聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore），使用5%脱脂奶粉和0.1% Tween-20将膜密封在Tris缓冲盐水中，轻轻摇动，并与JAK2、STAT3 和GAPDH 一抗在4 °C 下反应过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育，用电化学发光试剂处理蛋白质，曝光并检测，使用Image-J 软件对所有数据进行分析和量化，GAPDH用作加载控件。

6.统计学方法

采用SPSS 26.0 软件（IBM 公司）对数据进行统计处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P<0.05 表明差异有统计学意义。

结 果

1.各组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比较

模型对照组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度均低于正常对照组，骨小梁分散度高于正常对照组（均P<0.05）；右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度高于模型对照组，骨小梁分散度均低于模型对照组（均P<0.05）；联合治疗组股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组，骨小梁分散度低于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）。见表1。

表1 各组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比较（± s）

表1 各组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比较（± s）

注：正常对照组未做任何干预；模型对照组构建骨质疏松性骨折模型；正常对照组和模型对照组均给予等体积生理盐水灌胃；右归丸组构建骨质疏松性骨折模型+右归丸灌胃；骨髓间充质干细胞组构建骨质疏松性骨折模型+注射骨髓间充质干细胞；联合治疗组构建骨质疏松性骨折模型+右归丸灌胃和注射骨髓间充质干细胞。BMD 为骨密度。与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与右归丸组比较，cP<0.05；与骨髓间充质干细胞组比较，dP<0.05

n组别正常对照组模型对照组右归丸组骨髓间充质干细胞组联合治疗组10 10 10 10 10 BMD（g/cm3）2.06±0.18 1.10±0.13a 1.41±0.15b 1.47±0.14b 1.76±0.13bcd骨小梁分散度（mm）0.20±0.02 0.68±0.01a 0.42±0.03b 0.43±0.03b 0.34±0.02bcd骨小梁数量（个/mm）6.65±0.25 2.36±0.24a 3.88±0.28b 3.89±0.28b 5.87±0.24bcd骨小梁厚度（mm）0.19±0.02 0.05±0.01a 0.10±0.02b 0.09±0.03b 0.14±0.03bcd

2.各组家兔股骨股骨micro-CT扫描结果的影响

正常对照组股骨骨小梁结构正常，密度较大，可见相互连接的网状结构；模型组股骨骨小梁结构异常疏松，数量明显减少，且骨小梁网状结构减少，相互独立；经过右归丸、BMMSCs 以及联合治疗干预后，股骨骨小梁结构趋于正常，密度增加，网状结构也增加，且联合治疗效果均优于右归丸、BMMSCs单独治疗效果。见图1。

3.各组家兔股骨生物力学性能指标比较

模型对照组家兔股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均低于正常对照组（均P<0.05）；右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均高于模型对照组（均P<0.05）；联合治疗组家兔股骨弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）。见表2。

表2 各组家兔股骨骨生物力学性能指标比较（± s）

表2 各组家兔股骨骨生物力学性能指标比较（± s）

注：正常对照组未做任何干预；模型对照组构建骨质疏松性骨折模型；正常对照组和模型对照组均给予等体积生理盐水灌胃；右归丸组构建骨质疏松性骨折模型+右归丸灌胃；骨髓间充质干细胞组构建骨质疏松性骨折模型+注射骨髓间充质干细胞；联合治疗组构建骨质疏松性骨折模型+右归丸灌胃和注射骨髓间充质干细胞。与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与右归丸组比较，cP<0.05；与骨髓间充质干细胞组比较，dP<0.05

弹性模量（MPa）395.96±17.52 204.35±18.65a 304.62±20.41b 299.54±16.94b 343.27±21.04bcd组别正常对照组模型对照组右归丸组骨髓间充质干细胞组联合治疗组n 10 10 10 10 10刚度（N/mm）1 237.71±63.22 478.24±70.35a 698.52±69.55b 720.33±69.48b 904.25±73.25bcd最大应力（N/mm2）42.25±3.74 19.11±3.25a 25.34±3.22b 23.24±3.13b 32.63±3.17bcd最大承载力（N）428.99±10.76 201.85±13.58a 297.34±13.24b 289.38±13.13b 358.85±13.02bcd

4.各组家兔股骨病理形态学结果比较

正常对照组家兔股骨结构正常；模型组股骨小梁稀疏，可见空洞结构；经右归丸、骨髓间充质干细胞联合治疗后，骨小梁密度增加，空骨腔减少；联合治疗效果均优于右归丸、骨髓间充质干细胞单独治疗效果。见图2。

图2 各组家兔右侧股骨组织形态比较（HE染色 ×200）。A：正常对照组；B：模型对照组；C：右归丸组；D：骨髓间充质干细胞组；E：联合治疗组

5.各组家兔股骨组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平比较

模型对照组家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平均低于正常对照组（均P<0.05）；右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA水平均高于模型对照组（均P<0.05）；联合治疗组家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平均高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）。见表3。

表3 各组家兔股骨组织JAK2、STAT3 mRNA水平比较

6.各组家兔股骨组织JAK2蛋白、STAT3蛋白水平比较

模型对照组家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均低于正常对照组（均P<0.05）；右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均高于模型对照组（均P<0.05）；联合治疗组家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）。见表4、图3。

图3 各组家兔股骨组织JAK2、STAT3 蛋白表达的印迹图。A：正常对照组；B：模型对照组；C：右归丸组；D：骨髓间充质干细胞组；E：联合治疗组

表4 各组家兔股骨组织JAK2、STAT3蛋白水平比较

讨 论

骨质疏松性骨折愈合是骨骼局部修复的复杂生理过程；这一过程涉及成骨细胞和破骨细胞等直接参与骨重塑和骨吸收的细胞；愈合早期产生的大量成骨细胞对于骨质疏松性骨折的修复至关重要。相关研究证实，骨质疏松性骨折后，BMMSCs 迁移至骨折部位增殖并分化为成骨细胞［11］。成熟的成骨细胞分泌一种称为类骨质的基质物质，然后嵌入类骨质中并分化为骨细胞，然后钙化形成骨基质。最终，骨折的愈合以骨组织的形成而告终。BMMSCs 在骨质疏松性骨折的整个修复过程中发挥着重要的作用。BMMSCs 已应用于骨折的治疗，例如骨不连。移植培养扩增的BMMSCs可以增强局部修复。

中医虽无骨质疏松症之名，但从其临床表现和发病机制来看，属于骨枯范畴。《素问》认为骨枯的基本病理是骨枯骨髓减少。具体来说，骨枯病相当于骨组织微结构的退化和改变，表现为骨小梁变薄、断裂，从而改变了骨组织的正常负荷功能，增加了骨的脆性；骨髓减少对应的是骨量减少，包括骨基质和骨矿物质等比例地减少。由于骨萎的内容与骨质疏松的病机和临床表现相同，因此将骨萎作为骨质疏松的中医临床诊断［12］。中医理论认为，肾藏精、主骨、生髓，为先天之本，说明肾与精骨、髓之间存在着内在的生理关系，形成肾学说［13］。中医理论认为，骨质疏松的发病机制与衰老、先天遗传、劳累损伤、饮食习惯、机械应激等因素导致的肾虚有关。右归丸的用途很多，如补肾强骨、修复损伤、止痛等，其通过调节多种信号通路来控制骨质疏松，具有增加骨生成、稳定骨结构、增强成骨细胞增殖和分化、抑制破骨细胞的作用［14］。此外，右归丸能增加人体对钙的吸收，促进钙转运入骨，强化骨矿化，维持骨重塑的平衡；调节下丘脑-垂体-性腺轴的代谢水平、改善内分泌功能、抑制骨代谢中炎症因子的合成和分泌具有潜在的抗骨质疏松作用。研究表明，右归丸与CaCO3联合使用对雌激素缺乏引起的骨质流失有预防作用；右归丸可以增加骨含量，降低RANK 和RANKL 含量，改善卵巢摘除模型大鼠骨丢失，促进卵巢摘除模型大鼠骨折骨小梁的修复［15］。

本研究结果显示，右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均高于模型对照组（均P<0.05），骨小梁分散度低于模型对照组（P<0.05）；联合治疗组股骨BMD、骨小梁数量、骨小梁厚度、弹性模量、刚度、最大应力、最大承载力均高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05），骨小梁分散度低于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）；经过右归丸联合BMMSCs 治疗后，股骨骨小梁结构趋于正常，密度增加，网状结构也增加。这说明，右归丸辅助BMMSCs 能明显促进家兔骨质疏松性骨折愈合。

成骨细胞和破骨细胞在骨发育和修复过程中受到多种局部因素的调节，包括骨微环境中的细胞因子和多种细胞因子信号通路，例如JAK/STAT 信号通路。JAK/STAT 信号通路最初被确定为主要响应干扰素γ 和白细胞介素6 家族成员受体激活的通路。JAK 家族成员包括JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2；细胞质转录因子STAT 的磷酸化是由细胞因子通过JAK2/STAT2 信号通路与细胞表面的受体结合而触发的。JAK2/STAT2 信号通路在各类细胞的生长和分化中发挥着关键作用。许多激活该通路的细胞因子可影响成骨细胞和破骨细胞的增殖和分化，体外激活JAK2/STAT2信号通路可以增强碱性磷酸酶活性并增加骨钙素表达，表明其可以促进成骨细胞的分化［16-17］。一项体外研究通过JAK 抑制剂抑制BMMSCs 中JAK2 的表达，发现BMMSCs 的增殖和迁移能力减弱，提示JAK2/STAT3 信号通路对BMMSCs 有一定的影响［18］。STAT3 可以促进增殖并增强抗炎活性，而JAK 抑制剂抑制JAK2 的表达并减弱STAT3 的活性，从而导致细胞增殖能力下降［19］。本研究结果显示：模型对照组家兔股骨JAK2 mRNA 和蛋白、STAT3 mRNA 和蛋白水平均低于正常对照组（均P<0.05）；右归丸组、骨髓间充质干细胞组、联合治疗组家兔股骨JAK2 mRNA和蛋白、STAT3 mRNA和蛋白水平均高于模型对照组（均P<0.05）；联合治疗组家兔股骨JAK2 mRNA 和蛋白、STAT3 mRNA 和蛋白水平均高于右归丸组、骨髓间充质干细胞组（均P<0.05）。这说明，右归丸辅助BMMSCs 能明显促进骨质疏松性骨折家兔股骨高表达JAK2、STAT3，进而激活JAK2/STAT3 信号通路。这也是右归丸辅助BMMSCs 能明显促进家兔骨质疏松性骨折愈合的机制之一。

综上所述，右归丸辅助BMMSCs 能明显促进家兔骨质疏松性骨折愈合［20］，其机制可能与右归丸辅助BMMSCs 治疗能激活骨质疏松性骨折家兔股骨JAK2/STAT3 信号通路有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明朱俊：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，对文章的知识性内容作批性审阅，统计分析，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献；姚帅辉：酝酿和设计实验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，起草文章，对文章的知识性内容作批性审阅，统计分析，获取研究经费；郭小磊：实施研究，采集数据，分析/解释数据，统计分析，行政、技术或材料支持