血清miR-203和壳多糖酶3样蛋白1联合检测对肝显著纤维化/肝硬化的诊断价值

华 馨,朱 喆,楼柯宏,施 敏

宁波市第二医院检验科,浙江宁波 315010

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的关键步骤,而乙型肝炎病毒感染又是造成肝纤维化和肝硬化的主要原因[1]。肝纤维化是慢性肝脏疾病的动态发展过程[2],积极准确的早期诊断和有效的抗病毒治疗可阻断肝纤维化、减少肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)的发生。肝脏组织病理活检(肝活检)目前仍是肝纤维化诊断的“金标准”[3],但肝活检的有创性、高成本让患者不易接受,限制了其在临床的应用,因此选用无创技术评估肝纤维化程度非常必要。目前无创评估肝纤维化程度的技术主要有血液学指标检测和影像学评估。血液学指标如传统的肝纤维化4项[Ⅲ型前胶原(P-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层粘连蛋白(LN),透明质酸酶(HA)]和基于血液学检测指标得出的天门冬氨酸氨基转移酶-血小板比值指数(APRI)、肝纤维化指数(FIB-4)在临床诊断中特异度不高,诊断价值有限[4-5]。瞬时弹性成像(TE)能够准确地检测大多数患者的肝纤维化程度,但它对于孕妇和有腹水的患者并不适用,而且其结果会因操作者的不同存在主观性差异[6]。因此,探寻新的可靠的血清学诊断和预后监测的指标具有至关重要价值。目前微小核糖核酸(miRNA)在肿瘤诊断方面作为生物标志物的作用被广泛而深入地进行了研究,有研究发现miR-203在肝纤维化患者中有异常表达,并随着肝纤维化程度的加重而降低[7]。壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)是一种新兴的生物标志物,可用于肝脏疾病的诊断[8],但对于肝纤维化分期的应用价值研究有限。本研究旨在通过构建miR-203联合CHI3L1的诊断模型,探讨其对肝显著纤维化/肝硬化的诊断价值,并与现有的血清标志物及诊断指标进行比较。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2022年1月至2022年12月于本院住院的慢性乙型肝炎(CHB)患者纳入研究。纳入标准:(1)乙型肝炎表面抗原阳性半年以上,诊断参照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[9]。(2)进行过肝活检且有明确的肝纤维化分期。肝纤维化分期标准参照改良Metavir评分系统[10]：F0期为无肝纤维化;F1期为汇管区纤维化扩大,无纤维间隔;F2期为在F1期基础上有纤维间隔形成和桥接纤维化,大部分小叶结构保留;F3期为大量纤维间隔形成伴小叶结构紊乱,无肝硬化;F4期为早期肝硬化,肝实质破坏广泛。排除标准:(1)合并其他类型肝炎病毒感染,如甲型肝炎病毒(HAV)、戊型肝炎病毒(HEV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)等;(2)合并其他类型病毒感染;(3)合并酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤等;(4)合并血液系统疾病和恶性肿瘤等。本研究共纳入80例CHB患者,其中男49例,女31例,年龄33～74岁。根据肝活检结果将CHB患者分为无/轻度纤维化组(F0～F1期)50例,其中男31例,女19例,年龄55(47,62)岁;肝显著纤维化/肝硬化组(F2～F4期)30例,其中男18例,女12例,年龄50(52,68)岁。另外,选取同期体检健康者40例作为健康对照组,其中男24例,女16例,年龄45(33,65)岁。各组间年龄、性别等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2仪器与试剂 主要仪器包括ABI7500型实时荧光定量PCR检测仪(qPCR)、美康生物3080型化学发光仪、西门子2400型全自动生化仪完成、安图A2000型全自动化学发光测定仪。主要试剂包括miRNA提取试剂盒(德国Qiagen)、反转录合成cDNA反应试剂体系(日本TaKaRa)、qPCR试剂(日本TaKaRa)、CHI3L1磁珠法发光试剂盒(宁波美康),丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂(宁波塞克),肝纤维化4项(HA、P-Ⅲ、LN、C-Ⅳ)检测试剂(郑州安图)。

1.3方法

1.3.1标本采集 所有血清标本在采集后2 h内,2 000 r/min离心10 min,-80 ℃保存。

1.3.2qPCR检测血清miR-203水平 首先,根据试剂盒说明提取miRNA,进行Poly(A)加尾反应和反转录。qPCR检测采用SYBR Green染料法进行定量分析。反应体系20 μL:TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL,上下游引物各0.8 μL,ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL,DNA 2 μL,灭菌水6 μL。反应条件:95 ℃预变性30 s;40个循环,每循环为95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,72 ℃ 15 s。引物序列由上海生工生物工程公司设计并合成。引物序列如下:miR-203正向引物5′-CCGGGTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3′,miR-203反向引物5′-GCCGCG TGAAATGTTTAG-3′;内参为U6,检测结果根据标准曲线由软件自动给出Ct值,用2-ΔΔCt表示目的产物的表达水平。

1.3.3APRI和FIB-4的计算 APRI=AST/AST正常值上限×100/血小板计数(PLT);FIB-4=(年龄×AST)/PLT×ALT1/2。PLT的单位均为×109/L。

1.3.4CHB患者治疗前后血清miR-203和CHI3L1水平的比较 观察并比较34例CHB患者抗病毒治疗前后的血清miR-203和CHI3L1水平。

1.4统计学处理 采用SPASS27.0进行统计学分析。计量资料呈非正态分布,以M(P25,P75)表示,两组间比较采用Wilcoxon秩和检验,多组间比较采用Kruskal-WalliasH秩和检验;采用Spearman关性分析miR-203、CHI3L1和各纤维化指标的相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-203和CHI3L1单独以及联合诊断肝显著纤维化/肝硬化的价值,分析灵敏度、特异度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组间肝纤维化指标比较 3组间血清ALT、AST、P-Ⅲ、C-Ⅳ、LN、HA、CHI3LI、miR-203、APRI、FIB-4比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。肝显著纤维化/肝硬化组与健康对照组间上述各项指标比较,差异均有统计学意义(P<0.05);无/轻度纤维化组与健康对照组比较,除ALT、AST、APRI、FIB-4差异无统计学意义(P>0.05)外,其他指标差异均有统计学意义(P<0.05);肝显著纤维化/肝硬化组与无/轻度纤维化组比较,除LN差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各项指标差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 3组间肝纤维化指标的比较[M(P25,P75)]

2.2miR-203和CHI3LI与各项肝纤维化指标的相关性分析 miR-203与HA、C-Ⅳ、FIB-4、ALT呈负相关(r=-0.318、-0.282、-0.238、-0.224,P<0.05),与PLT呈正相关(r=0.298,P<0.05),而与其他指标P-Ⅲ、LN、AST、APRI无相关性(P>0.05);CHI3LI与ALT、HA、LN、C-Ⅳ、APRI、FIB-4呈正相关(r=0.316、0.467、0.254、0.296、0.300、0.284,P<0.05),与PLT呈负相关(r=-0.506,P<0.05),见表2。

表2 miR-203和CHI3LI与各项肝纤维化指标的相关性分析

续表2 miR-203和CHI3LI与各项肝纤维化指标的相关性分析

2.3miR-203、CHI3LI单独及联合检测诊断肝显著纤维化/肝硬化的效能分析 miR-203和CHI3LI单独诊断肝显著纤维化/肝硬化的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.820和0.873,高于APRI和FIB-4(P<0.05),CHI3LI具有较高的灵敏度,但特异度略差。两个指标联合诊断的ROC曲线AUC为0.895,灵敏度和特异度分别为93.5%和73.1%,优于单独诊断的效能(P<0.05)。见表3。

表3 miR-203和CHI3LI单独及联合诊断肝显著纤维化/肝硬化的效能比较

2.4CHB患者抗病毒治疗前后miR-203和CHI3LI水平的变化 34例CHB患者治疗后CHI3L1水平较治疗前明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);miR-203水平与治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 miR-203和CHI3L1水平在抗病毒治疗前后的比较[M(P25,P75),n=34]

3 讨 论

miRNA是动物和植物细胞中自然产生的含18～24个核苷酸的非编码小RNA[11]。miRNA可以通过调节肝星状细胞(HSC)的活化、增殖、凋亡以及肝纤维化相关信号转导通路在肝纤维化过程中发挥重要作用[12]。SONG等[13]研究发现miR-203在肝纤维化组织中用转化生长因子-β1(TGF-β1)处理的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中表达下调;HCC中的miR-203因启动子CpG高甲基化而沉默。戢敏等[14]研究发现,与未复发的HCC患者相比,复发者肝癌组织的miR-203表达水平较低;miR-203是一种潜在的肝癌抑制剂,较高的miR-203表达预测较好的预后[15]。本课题组前期的研究发现miR-203在CHB相关疾病中存在差异表达,miR-203可能通过抑制HSC的活化、增殖、凋亡,抑制巨噬细分泌白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1等炎症因子水平而发挥抗纤维化的功能。本研究中,miR-203的表达与肝纤维化程度呈负相关。以上研究提示miR-203可作为一种新型的分子诊断标志物用于肝纤维化的临床诊断。

CHI3L1是壳多糖酶家族一员,它能够参与炎症、细胞外基质的重构、细胞增殖分化等多种生理病理过程,CHI3L1可在多种组织中异常表达,如脑、肾组织等[16]。近期研究证实它在肝脏高富集表达,可以被用作肝脏疾病的诊断标志物,CHI3L1通过激活HSC活化,诱导蛋白激酶B(PKB)/AKT信号通路和TGF-β1产生,参与了肝纤维化的发生[17]。2019年的《慢性乙型肝炎防治指南》指出,外周血CHI3L1水平与肝纤维化密切相关。也有一些研究证实CHI3L1水平随纤维化的进程发展而表达增加[18],并且在诊断肝纤维化方面的表现优于传统的肝纤维化4项。所以CHI3L1作为肝脏相关疾病的诊断标志物是具有一定研究价值的,可继续探索其在肝纤维化分期中的应用。

由此可见,miR-203和CHI3LI可能通过促进HSC的活化和增殖而参与肝纤维化的过程。本研究也证实了miR-203和CHI3LI在肝纤维化患者中的差异表达,而且相较于ALT、AST、APRI、FIB-4等指标具有更高的灵敏度。在无/轻度纤维化组与健康对照组的比较中,ALT、AST、APRI、FIB-4差异无统计学意义(P>0.05)。该发现也与已有的研究一致,CHB患者的ALT和AST水平与肝纤维化程度并不是总是一致[19]。Spearman相关分析显示,血清CHI3L1水平与肝纤维化评价指标(HA、LN、C-Ⅳ)、无创诊断模型指标(APRI、FIB-4)相关,miR-203与HA、C-Ⅳ、FIB-4、ALT等指标相关,提示血清CHI3L1和miR-203水平与肝纤维化程度相关。这些研究结果说明miR-203和CHI3LI均可作为理想的血清学指标用于肝纤维化的诊断。本课题组分析了miR-203和CHI3LI单独和联合诊断肝显著纤维化/肝硬化的效能,发现在单独诊断时miR-203和CHI3LI的AUC分别为0.820和0.873,优于APRI和FIB-4(AUC分别为0.770和0.801),尤其是CHI3LI灵敏度为96.8%,miR-203在灵敏度(80.6%)和特异度(73.1%)方面均表现出较大的优势。APRI和FIB-4各自在灵敏度或者特异度方面存在不足,影响了其在临床中的应用。miR-203和CHI3LI联合诊断肝显著纤维化/肝硬化,AUC为0.895,灵敏度(93.5%)和特异度(73.1%)均较高。所以miR-203和CHI3LI联合诊断对于诊断肝显著纤维化/肝硬化具有实际应用价值,让无创诊断的优势最大化。

长期抗病毒治疗的目的是阻断肝纤维化、减少肝硬化甚至HCC的发生。有研究发现,经过干扰素和核苷类似物治疗的CHB患者,CHI3LI水平明显下降[18]。因此,在CHB患者抗病毒治疗过程中除了检测生化指标和病毒学指标外,也可以通过监测CHI3LI浓度的变化来评价抗病毒疗效[20]。本课题组比较了34例经过抗病毒治疗患者的miR-203和CHI3LI变化,CHI3LI水平有较明显的下降(P<0.05),而miR-203相较治疗水平差异无统计学意义(P>0.05),这可能与研究样本量有限有关。

综上所述,miR-203和CHI3LI在肝纤维化患者中异常表达,并与肝纤维化指标有相关性,证实两个分子参与了肝纤维化过程。同时,诊断效能的研究结果说明两个指标的诊断效能优于传统的无创评价指标,同时也可用于抗病毒治疗的疗效观察,miR-203和CHI3LI联合应用于肝纤维化/肝硬化的诊断和抗病毒治疗疗效评估具有较高的价值,有利于降低严重肝病的发生率。