狼疮性肾炎患者肾组织差异表达基因筛选及功能分析

郭文涛,刘瑛琦,王 希,郜赵伟,李锐成△

1.空军军医大学第二附属医院检验科,陕西西安 710038;2.空军军医大学基础医学院四大队,陕西西安 710038

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多发于中青年女性的自身免疫性疾病,可引起全身各系统各脏器的损伤。其中,SLE所致肾脏受累,可引起狼疮性肾炎(LN),是SLE所引起的最常见器官损伤之一,可表现为血尿、蛋白尿、肾功能不全、免疫复合物沉积等[1]。LN所致的严重肾脏损伤是SLE患者的主要死亡原因之一。LN的发病机制目前尚不清楚。本研究利用基因表达数据库(GEO),筛选LN患者肾脏组织中差异表达基因(DEGs),同时,关注DEGs在LN患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达情况,为探讨LN发病机制提供理论依据,并为LN发掘潜在的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 GSE32591数据集包括如下转录组信息:32例LN肾小管间质和15例正常肾小管间质;32例LN肾小球和14例正常肾小球;GSE112943数据集包括14例LN肾组织和7例正常肾组织的转录组信息;GSE81622数据集包括15例LN患者PBMC和25例健康对照PBMC的转录组信息。

1.2方法

1.2.1DEGs筛选 利用GEO2R分析工具对数据集进行分析,筛选LN肾组织中的DEGs(log2FC≥1或≤-1且P<0.01),对3组DEGs取交集,得到共有的DEGs。

1.2.2基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 利用DAVID生物信息分析工具(version 6.8,https://david.ncifcrf.gov/)对DEGs进行GO注释和KEGG分析,利用R软件(version 4.0.2)制作气泡图对GO和KEGG分析结果进行可视化。

1.2.3蛋白互作网络(PPI)分析 利用STRING在线数据库(https://www.string db.org/)对DEGs编码蛋白进行PPI构建,筛选联合评分>0.9的高置信度互作节点数据,互作类型或证据来源包括:实验验证、数据库、共表达、基因融合及共定位。利用K-means及MCL聚类进行PPI的Clusters分析,筛选核心DEGs。分析核心DEGs在LN患者PBMC中的表达变化情况。

1.3统计学处理 DEGs利用t检验的P值和差异倍数进行筛选,筛选标准:|log2FC|≥1及P<0.01。对DEGs进行GO及KEGG分析,双侧检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1DEGs筛选结果 根据DEGs筛选标准,分别在GSE10325数据集的LN肾小管间质、肾小球及GSE112943数据集的LN肾组织中筛选到124 345和8 633个DEGs。取交集后,共筛选到45个共有DEGs,其中37个基因表达上调,8个基因表达下调。见图1。

注:A为Venn图显示DEGs数量;B为45个共有DEGs在3组数据集中的表达变化情况。

2.2共有DEGs的功能分析 利用DAVID对LN肾组织中的45个DEGs进行GO和KEGG分析。GO功能注释包括生物学过程(GO_BP)、细胞组成(GO_CC)及分子功能(GO_MF)。结果显示,上述DEGs主要参与对病毒的响应、Ⅰ型干扰素信号通路、病毒防御、病毒基因组复制负调控、干扰素响应、固有免疫响应等生物学过程;主要位于细胞质、溶酶体膜及细胞外基质;分子功能包括RNA结合、GTP结合、解旋酶活性、MHCⅡ受体活性。KEGG通路分析显示,上述DEGs主要参与的信号通路包括单纯疱疹病毒感染、麻疹病毒感染、EB病毒感染、金黄色葡萄球菌感染等。见图2。

注:A为GO_BP分析结果气泡图;B为GO_CC及GO_MF分析结果气泡图;C为KEGG分析气泡图。

2.3DEGs编码蛋白互作分析 通过PPI构建和聚类分析,构建1个核心PPI模块,共包含12个基因:早期生长反应蛋白1(EGR1)、FosB原癌基因(FOSB)、干扰素α诱导蛋白27(IFI27)、干扰素α诱导蛋白6(IFI6)、干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白2(IFIT2)、干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白3(IFIT3)、干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)、干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM3)、干扰素诱导的GTP结合蛋白Mx1(MX1)、干扰素诱导的GTP结合蛋白Mx2(MX2)、2′5′寡核苷酸合成酶1(OAS1)、XIAP相关因子1(XAF1)。在12个核心DEGs中,除FOSB仅与ERG1发生关联外,其余11个基因均相互关联。见图3。

注:A为12个核心DEGs;B为核心DEGs的互作基因数量。

2.4PPI核心DEGs在LN患者PBMC中的表达分析 利用GSE81622数据集,对12个关键DGEs在LN患者PBMC中的表达情况进行分析。与LN肾组织中的表达变化情况相一致的基因有9个:IFI27、MX1、IFITM3、IFI6、IFIT3、IFIT2在LN患者PBMC中表达显著上调(P<0.01),而且上调倍数大于2;MX2、OAS1、XAF1在PBMC中表达上调(P<0.01),上调倍数小于2。此外,不一致的基因有3个:IFITM1和FOSB在LN患者PBMC中改变差异无统计学意义(P>0.05),与LN肾组织中的表达变化不一致;EGR1在LN患者PBMC中表达上调(P=0.024),与LN肾组织中的表达变化情况相反。见表1。

表1 LN肾组织中12个DEGs在PBMC中的表达变化分析

3 讨 论

利用基因表达公共数据库,是筛选疾病相关关键基因的重要手段。本研究利用包含LN肾组织及其正常对照组织转录组数据集,共获得了37个表达上调及8个表达下调DEGs。功能富集分析表明,45个DEGs主要与机体对病毒感染的响应及干扰素信号调控相关。进一步通过PPI分析获得12个核心DEGs,分别为:EGR1、FOSB、IFI27、IFI6、IFIT2、IFIT3、IFITM1、IFITM3、MX1、MX2、OAS1、XAF1。大多数DEGs均为干扰素信号通路相关基因。其中,EGR1在LN肾组织中表达下调,其余11个DEGs均表达上调。

LN是一种自身免疫性疾病,包括病毒感染在内的各种因素引起的免疫调节紊乱(促炎症免疫因素的过度产生和抑炎症免疫因素的抑制)。自身免疫反应和自身抗体的形成既是患者重要的临床特征,也是LN发生发展的重要驱动因素。TRIZZINO等[2]最近的研究显示,EGR1能够抑制巨噬细胞中促炎症基因的表达,抑制发育中和成熟的巨噬细胞中的炎症增强子的功能,从而削弱其活性和免疫反应。因此,LN肾组织中EGR1表达水平的下调可能导致其对巨噬细胞促炎症反应抑制能力不足,导致过激炎症反应,促进LN发展。有研究报道了EGR1在SLE患者中表达上调[3]。KOPEC等[4]研究发现EGR1表达降低与自身免疫性肝病小鼠的肝纤维化损伤相关,提示EGR1在自身免疫病组织损伤过程中发挥重要作用。

FOSB是Fos基因家族成员之一,其编码蛋白是转录因子复合体AP-1的组成部分,参与调控细胞的增殖及分化。FOSB在SLE中的研究鲜见报道。FOSB在LN肾组织中的表达升高提示LN肾组织中相关细胞的增殖发生异常,此外,LN患者PBMC中FOSB表达无变化。PPI分析显示,FOSB与EGR1之间存在互作,提示可能共同参与调控LN肾组织中的巨噬细胞增殖及活性。

XAF1是XIAP相关因子1,XIAP是X染色体连锁的凋亡抑制蛋白。目前的研究显示,XAF1在促进细胞凋亡过程中发挥重要作用[5]。在正常情况下,机体内的凋亡细胞会被及时清除,然而,当清除机制发生异常时,凋亡细胞增多便会导致细胞内容物外泄产生自身抗原,从而引发自身免疫性炎症和产生自身抗体。有研究显示,SLE患者体内巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力降低[6-7]。因此,XAF1的促细胞凋亡作用,可能会导致自身抗原大量释放,促进自身免疫的发生发展。已有研究发现,XAF1在多种自身免疫性疾病患者中表达异常,包括干燥综合征[8-9]和系统性硬化[10]。XIANG等[11]在盘状红斑狼疮患者中也发现了XAF1的表达变化,表明XAF1在SLE发生发展中作用关键。

干扰素是一类多功能的细胞因子,生物功能广泛,在天然免疫应答中发挥重要作用。IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。干扰素与其受体结合后,可以诱导几百种基因的表达。本文筛选到的核心DEGs IFI27、IFI6、IFIT2、IFIT3、IFITM1、IFITM3、MX1、MX2、OAS1、XAF1均属于干扰素诱导基因,其在LN肾组织中表达水平均升高,并且其中绝大多数基因在LN的PBMC中表达也上调,表明IFN信号通路活性在LN患者中上调,在LN发生发展过程中具有关键作用。KHAMASHTA等[12]通过随机双盲对照临床研究发现,抗IFN-α单抗Sifalimumab治疗可以明显缓解SLE患者的病情。最近,一种Ⅰ型干扰素受体抗体药物-Saphnelo获FDA批准,用于治疗正接受标准治疗的中重度成人SLE患者[13],临床研究数据显示,靶向封闭Ⅰ型干扰素受体,Saphnelo明显降低SLE疾病活动度[14-16],其常见不良反应之一即增加了患者带状疱疹感染的风险。由此可见,封闭IFN信号通路活性可能成为LN患者潜在的有效治疗手段,更好的靶点选择有利于增强疗效,降低不良反应。本文筛选的LN肾组织中表达上调的IFN信号相关基因为治疗靶点的选择提供参考。

本研究筛选了LN肾组织中12个关键表达差异基因,并对其功能进行了分析,为LN发生发展分子机制提供理论参考。需要注意的是,LN肾组织中DGEs的表达变化方向(上调/下调)与其在LN患者PBMC中的变化方向并不完全一致,表明LN病理组织及其微环境与机体循环中的分子信号变化存在显著不同。下一步需要在相关的细胞及SLE动物模型中对上核心基因进行功能验证。