血清circVMA21水平对脓毒症患者预后评估的价值

任艳艳,杨宏锋

江苏省镇江市第一人民医院重症医学科,江苏镇江 212000

脓毒症是由感染引发的全身炎症反应和机体免疫功能紊乱,会导致各个器官的炎症损伤。早期诊断脓毒症并予以适当的抗菌药物、液体和血管活性药物治疗对减少器官/系统损伤和降低病死率十分重要[1-2]。脓毒症的诊断具有滞后性,但患者的病情发展非常迅速,如果不能得到及时、有效地治疗,患者往往会发展为脓毒性休克,病死率较高[3]。因此,寻找评估脓毒症预后的生物评估指标,对于降低病死率显得十分重要[4]。circRNA是一类非编码RNA,是由转录本两端的共价键结合而形成的闭环结构,主要在转录过程中发挥调节作用,已有研究证实circRNA可以影响脓毒症发病[5-6]。有研究证明,环状RNA液泡ATP酶组装因子(circVMA21)在脂多糖(LPS)诱导的脓毒症中发挥作用[7]。但是,脓毒症患者血清中circVMA21表达水平及其对脓毒症的影响和作用机制尚不明确,本研究检测脓毒症患者血清circVMA21水平,并对其在脓毒症患者预后评估中的价值进行分析,从而为脓毒症的早期治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2020年7月至2022年12月本院收治的200例脓毒症患者纳入研究作为脓毒症组,其中男105例,女95例,年龄18～70岁,平均(50.45±6.97)岁。纳入标准:(1)通过检查诊断为脓毒症的患者,并且符合脓毒症相关诊断标准[8],(2)肝肾功能正常,(3)首次确诊。排除标准:(1)合并自身免疫等免疫系统疾病,(2)合并慢性炎症反应疾病,(3)合并血液系统疾病,(4)合并肝肾疾病、恶性肿瘤,(5)妊娠期或哺乳期女性,(6)信息缺失及无法配合研究者。另外,选取同期于本院治疗的普通感染患者200例作为对照组(普通感染患者是指未引起严重脏器功能损害的感染者),其中男101例,女99例,年龄19～69岁,平均(51.23±6.78)岁。纳入研究者及其家属均知情同意并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 记录纳入研究者性别、年龄、体重、身高、体重指数(BMI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、血清超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞计数(NEU)、血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血红蛋白(Hb)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(Cr)、血气分析指标血氧饱和度(SaO2)等各项指标的检测结果。

1.2.2标本采集与保存 纳入研究者入院后24 h内采集5 mL空腹静脉血标本,于室温静置30 min后,3 000 r/min离心15 min,取上层血清,密封放置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.3各项临床实验室指标的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α水平,试剂盒采购于上海酶联生物公司(货号:ml077385)。采用日本希森美康公司XN-1000型血细胞分析仪通过流式细胞计数法测定WBC、NEU。采用美国雅培公司Ci8200型全自动生化分析仪通过化学发光法检测CK-MB水平,通过电化学法检测cTnI水平,通过比浊法检测hs-CRP水平。血常规检测采用迈瑞BC5800型全自动血细胞分析仪检测Hb水平。采用日立7170型全自动生化分析仪检测ALT、AST、Cr水平。采用飞利浦VM6型心电监护仪检测SaO2水平。各项指标的检测严格按照说明书进行操作。

1.2.4血清circVMA21水平的检测 采用实时荧光定量(qPCR)法测定血清circVMA21水平,使用Trizol(Invitrogen)试剂提取血清总RNA,采用紫外分光光度计测总RNA纯度和浓度,用反转录试剂盒将部分RNA反转录为cDNA,-20 ℃冰箱保存备用。采用SYBR Premix EX TaqTM试剂盒配制qPCR反应体系,引物序列见表1,引物由尚亚生物工程公司合成。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环40次。采用2-ΔΔCt法计算circVMA21的相对表达水平,GAPDH作为内参。为排除实验误差,所有检测样品设置3个复孔进行检测。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.5计算SOFA评分、APACHEⅡ评分 计算脓毒症患者序贯性器官衰竭(SOFA)评分、急性生理学及慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分。SOFA评分≥2分时,可诊断为脓毒症。APACHEⅡ评分分值越高说明病情越严重。

1.2.6随访 对患者治疗后28 d内的生存情况进行随访。根据脓毒症患者治疗后28 d是否存活,将其分为预后良好组和预后不良组。

2 结 果

2.1两组血清circVMA21水平比较 脓毒症组血清circVMA21水平低于对照组,差异有统计学意义(0.69±0.15vs.1.03±0.26,P<0.05)。

2.2血清circVMA21水平与SOFA评分、APACHEⅡ评分的相关性 脓毒症患者血清circVMA21水平与SOFA评分、APACHEⅡ评分均呈负相关(r=-0.553、-0.543,P<0.001),见图1、2。

图1 脓毒症患者血清circVMA21水平与SOFA评分的相关性

图2 脓毒症患者血清circVMA21水平与APACHEⅡ评分的相关性

2.3预后不良组和预后良好组血清circVMA21水平比较 根据脓毒症患者治疗后28 d的存活情况,将其分为预后良好组128例和预后不良组72例。预后不良组血清circVMA21水平低于预后良好组,差异有统计学意义(0.46±0.12vs.0.82±0.17,P<0.05)。

2.4不同预后的脓毒症患者临床资料比较 两组间男女比例、年龄、ALT、AST、Hb、Cr、SaO2比较,差异无统计学意义(P>0.05)。预后不良组CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA评分、APACHEⅡ高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 不同预后的脓毒症患者临床资料比较[n(%)或

2.5血清circVMA21水平对脓毒症患者预后不良的预测价值 以circVMA21水平为检验变量,以脓毒症患者是否预后不良(否=0,是=1)为状态变量,绘制ROC曲线。分析显示,circVMA21水平用于预测脓毒症患者预后不良的曲线下面积(AUC)为0.848(95%CI：0.793～0.902),当截断值为0.55,灵敏度为83.30%,特异度为78.90%,约登指数为0.622,见图3。

图3 circVMA21水平用于预测脓毒症患者预后不良的ROC曲线

2.6Kaplan-Meier法分析circVMA21与脓毒症患者预后生存的关系 对脓毒症患者治疗后进行28 d随访,以ROC曲线分析中得到的circVMA21相对表达水平用于预测脓毒症患者预后不良的截断值为界,将患者分为circVMA21>0.55与circVMA21≤0.55两组。Kaplan-Meier法分析显示,两组间累积生存率比较,差异有统计学意义(Log-rankχ2=5.138,P=0.023),见图4。

图4 circVMA21水平与脓毒症患者预后生存期的关系

2.7Logistic回归分析脓毒症患者预后的影响因素 以脓毒症患者是否预后不良为因变量(否=0,是=1),以CK-MB入院实测值、cTnI入院实测值、hs-CRP入院实测值、TNF-α入院实测值、WBC入院实测值、NEU入院实测值、APACHEⅡ入院实测值及circVMA21(相对表达水平>0.55=0,≤0.55=1)为自变量进行多因素Logistic回归分析。分析结果显示,APACHEⅡ是脓毒症患者预后不良的危险因素,circVMA21为保护因素(P<0.05),见表3。

表3 影响脓毒症患者预后不良的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

脓毒症是一种由创伤性感染引发的疾病,其病原体微生物包括真菌、细菌、寄生虫和病毒等[9]。严重创伤、多发伤、大手术或休克可能会导致脓毒症的发生。随着病情的加重,脓毒症可以发展为多器官衰竭,甚至死亡[10]。能够在脓毒症早期准确评估患者病情和预后并及时予以治疗,对于改善患者预后有十分重要的意义[11]。经典的检测指标有利于脓毒症的诊断,但在一定程度上有灵敏度和特异度的缺陷。因此,寻找灵敏度和特异度较高的用于脓毒症早期诊断和预后评估的指标是目前临床研究的热点[12]。

circRNAs可能在调节患者对不同病原体(细菌和病毒)的免疫反应中发挥十分重要的作用,例如在包括脓毒症在内的多种疾病的早期患者中出现circRNAs的失调,虽然脓毒症患者中circRNA水平发生改变,但控制这些circRNA失调的具体作用机制尚未完全明确[13]。有研究发现circRNAs影响了脓毒症的发病[14]。还有研究证实hsa_circRNA_104484、hsa_circRNA_104670这两种circRNA可以作为脓毒症的诊断标志物[15]。circVMA21可以通过调节miR-9-39/SMG1/炎症和氧化应激反应,在调节脓毒症相关的急性肾损伤中发挥重要作用[16]。还有研究证明circVMA21通过靶向miR-497-5p/CD2AP改善了脓毒症大鼠模型的肺损伤,circVMA21可能是脓毒症诱导的肺损伤新的治疗靶点[17]。

在本研究中,相较于对照组,脓毒症组CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA评分、APACHEⅡ评分较高;相较于预后良好组,预后不良组CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA评分、APACHEⅡ水平也较高。本研究的结果与既往研究的结果一致[18],提示CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA评分、APACHEⅡ评分可能与脓毒症的发生有关。脓毒症组circVMA21水平较低,而且预后不良组circVMA21水平低于生存组,说明circVMA21可能参与了脓毒症的发生发展,临床中应及时检测其表达水平,对评估脓毒症的发生有一定的价值。circVMA21水平与SOFA评分、APACHEⅡ评分均呈负相关,SOFA评分、APACHEⅡ评分可反映脓毒症患者病情的严重程度,circVMA21水平越低,表示患者病情越严重。ROC曲线分析显示,circVMA21对脓毒症预后不良有一定的预测价值,提示circVMA21可作为脓毒症患者预后的评估指标。APACHEⅡ是影响脓毒症患者预后的危险因素,circVMA21为保护因素,提示血清circVMA21水平和APACHEⅡ评分对评估脓毒症患者预后评估有一定价值。

综上所述,脓毒症患者血清circVMA21水平降低,而且预后不良患者血清circVMA21水平较预后良好患者低,与APACHEⅡ评分有关,提示脓毒症患者血清circVMA21可能与该病的发生发展相关。本研究为临床研究脓毒症的发病机制提供了新的研究方向,但circVMA21水平对脓毒症的影响及具体的作用机制还有待研究。本研究纳入病例数较少,并且未进行动态分析,没有对脓毒症患者不同时期血清circVMA21进行比较,结果可能存在一定的偏倚,今后需增加样本量进行研究和探讨。