膀胱癌患者血清miR-124、miR-320a水平与临床病理特征及生存预后的关系

王 丹,张前进,吴 娟△

宿迁市第一人民医院:1.医学检验科;2.泌尿外科,江苏宿迁 223800

膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,在发展中国家/地区病死率较高,主要症状为镜下血尿或肉眼血尿,复发率较高[1]。微小RNA(miRNA)的相互作用是机体的一种自我调节机制,在癌症发展过程中具有重要作用,能影响细胞的增殖、分化和凋亡[2]。miR-124主要存在于大脑中,能参与神经系统内神经元发育、神经传递等,调节骨髓细胞活性,在癌组织中水平较低,能抑制癌细胞的迁移和侵袭[3]。曾有研究表明,miR-124能通过调节DNA甲基转移酶抑制膀胱癌的迁移和侵袭[4]。miR-124在膀胱癌、胃癌等癌组织中下调,可作为膀胱癌、胃癌等癌症进展的肿瘤抑制因子[5]。miR-320a在乳腺癌、前列腺癌等癌症中常表现为下调,其与肿瘤分期有关,miR-320a缺失会导致肿瘤相关促进因子被激活,从而促进癌细胞发展和侵袭[6]。曾有研究表明,与正常膀胱细胞相比,miR-320a在膀胱癌细胞中下调,其过表达能抑制膀胱癌侵袭[7-8]。膀胱癌细胞中miR-124下调,miR-124能通过抑制STAT3表达减少肿瘤生长[9]。miR-124-3p能靶向抑制内皮素受体B型表达来调节膀胱癌细胞的增殖和凋亡[10]。miR-124[11]、miR-320a[7]可通过调节FOXQ1影响膀胱癌的进展,但二者是否与膀胱癌患者生存预后有关尚不明确,而且目前关于miR-124、miR-320a联合评估膀胱癌生存预后的研究相对较少。因此,本研究主要分析膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平变化,并探讨其在膀胱癌患者生存预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 将本院2018年2月至2020年2月收治的100例膀胱癌患者纳入研究作为研究组,男64例、女36例,年龄34～75岁、平均(62.16±8.74)岁。纳入标准:(1)经病理检查确诊,符合膀胱癌诊断标准[12];(2)患者临床资料完整;(3)未进行过放疗、化疗等抗肿瘤治疗;(4)随访资料完整。排除标准:(1)合并其他部位肿瘤;(2)其他脏器功能严重损伤;(3)具有血液或免疫系统疾病;(4)近期接受过激素治疗;(5)有急性泌尿系统感染。参照国际抗癌协会TNM分期标准[13],将患者分为Ta+T1期41例、T2～T4期59例。另外,选取100例同期体检健康者作为对照组,男60例、女40例,年龄35～73岁、平均(62.58±9.21)岁。研究组与对照组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。纳入研究者对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清miR-124和miR-320a水平 收集研究组入院时及对照组体检时采集的空腹外周静脉血标本,采用RN4601型血清RNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物)提取血清总RNA,再使用miRcute miRNA第1链cDNA合成试剂盒(德国Qiagen公司)得到cDNA。以U6作为内参,引物经设计软件设计后由上海真固生物科技有限公司合成。PCR反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s,共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-124和miR-320a的相对表达水平(下称水平)。引物序列见表1。

表1 miR-124、miR-320a qPCR检测的引物序列(5′-3′)

1.2.2随访 对研究组的膀胱癌患者以电话或门诊复查方式进行为期3年随访,随访截止时间为2023年2月,记录患者生存状况,计算生存率。

2 结 果

2.1两组血清miR-124和miR-320a水平比较 研究组血清miR-124、miR-320a水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

注:与对照组比较,*P<0.05。

2.2不同生存预后的膀胱癌患者血清miR-124、miR-320a水平比较 对研究组的膀胱癌患者随访36个月后(无失访患者),共死亡27例(死亡组),生存73例(生存组)。对不同生存预后的患者血清miR-124和miR-320a水平进行比较,生存组血清miR-124、miR-320a水平高于死亡组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注:与死亡组比较,*P<0.05。

2.3miR-124和miR-320a用于评估膀胱癌患者生存预后的价值 ROC曲线分析显示,miR-124评估膀胱癌患者生存预后的AUC为0.823,截断值为0.46,灵敏度为97.00%,特异度为69.86%;miR-320a评估膀胱癌患者生存预后的AUC为0.785,截断值为0.40,灵敏度为88.89%,特异度为60.27%;二者联合评估的AUC为0.880,灵敏度为92.57%,特异度为73.97%。联合评估的效能优于单一指标(ZmiR-124 vs. 联合=2.087,P=0.037;ZmiR-320a vs. 联合=2.489,P=0.013)。见表2、图3。

表2 血清miR-124和miR-320a水平用于膀胱癌患者生存预后评估的价值

图3 血清miR-124、miR-320a水平用于评估膀胱癌患者生存预后的ROC曲线分析

2.4血清miR-124和miR-320a水平的相关性分析 以ROC曲线分析中获得的miR-124、miR-320a截断值(0.46、0.40)的作为分界值,分别将膀胱癌患者分为miR-124高水平(43例)、低水平(57例),miR-320a高水平(45例)、低水平(55例)。由Spearman相关性分析可知,膀胱癌患者血清miR-124水平高低和miR-320a水平高低呈正相关(r=0.432,P<0.05)。见表3。

表3 miR-124和miR-320a水平高低的相关性

2.5血清miR-124和miR-320a水平与临床病理特征的关系 膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平与性别、年龄以及是否吸烟无关(P>0.05)。TNM分期为Ta+T1期、肿瘤最大径≤3 cm、淋巴结未转移的膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a高水平比例分别高于TNM分期为T2～T4期、肿瘤最大径>3 cm、淋巴结转移患者(P<0.05)。见表4。

表4 血清miR-124和miR-320a水平与临床病理特征的关系[n(%)]

2.6血清miR-124和miR-320a水平与膀胱癌患者生存预后的关系 100例膀胱癌患者3年总生存率为73.00%(73/100)。miR-320a高水平患者3年总生存率为88.89%(40/45),miR-320a低水平患者3年总生存率为60.00%(33/55);miR-124高水平患者3年总生存率为88.37%(38/43),miR-124低水平患者3年总生存率为61.40%(35/57)。Kaplan-Meier法分析显示,miR-124高水平患者3年累积生存率高于miR-124低水平患者(Log-rankχ2=9.314,P<0.05);miR-320a高水平患者3年累积生存率高于miR-320a低水平患者(Log rankχ2=10.827,P<0.05)。见图4、5。

图4 血清miR-124水平高低与膀胱癌患者3年累积生存率的关系

图5 血清miR-320a水平与膀胱癌患者3年累积生存率的关系

2.7多因素Cox回归分析膀胱癌患者生存预后的影响因素 以血清miR-124水平(低水平=0,高水平=1)、miR-320a(低水平=0,高水平=1)、TNM分期(Ta+T1=0,T2～T4=1)、淋巴结是否转移(是=0,否=1)、肿瘤最大径(≤3 cm=0,>3 cm赋值1)为自变量,以患者生存预后(生存=0,死亡=1)为因变量,进行Cox回归分析,结果显示,miR-124、miR-320a、TNM分期、淋巴结转移是膀胱癌患者生存预后的影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 膀胱癌患者生存预后影响因素分析

3 讨 论

膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一,吸烟是其主要危险因素,此外多种致癌物的暴露也是其发病的危险因素,对膀胱癌高危人群针对性地进行筛查可能会降低其病死率[13]。膀胱癌的发病机制复杂,涉及基因表达、蛋白功能障碍及多种信号通路,但具体的作用机制尚不明确[14]。miRNA能与mRNA结合,调节mRNA的翻译和转录,从而控制基因的表达,miRNA与肿瘤关系密切,能参与前列腺癌、肺癌等肿瘤细胞侵袭和转移[15-16],可作为肿瘤抑制因子或癌基因在机体内发挥作用[17]。因此,miRNA对膀胱癌的作用逐渐受到重视。

有研究表明,miR-320a在乳腺癌、结肠癌、膀胱癌等癌细胞系和组织中显著下调[18]。ZHANG等[19]报道,miR-124在膀胱癌癌细胞系和组织中表达水平明显较正常细胞/组织低,提高miR-124表达水平能抑制膀胱癌细胞的增殖和发展,促使其凋亡。CAO等[20]报道,miR-124在膀胱癌细胞中呈低表达,其过表达能抑制癌细胞活力,可能作为治疗膀胱癌的靶向位点。在本研究中,膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平低于健康志愿者,Spearman分析显示,膀胱癌患者血清中miR-124和miR-320a水平高低呈正相关,提示miR-124和miR-320a可能通过某种相互的正反馈机制抑制膀胱癌的发生。

ROC曲线分析表明,血清miR-124和miR-320a联合检测评估膀胱癌患者生存预后的效能优于单一指标,而且TNM分期为Ta+T1期、肿瘤最大径≤3 cm、淋巴结未转移的膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a高水平比例分别显著高于TNM分期为T2～T4期、肿瘤最大径>3 cm、淋巴结转移患者,提示miR-124和miR-320a与膀胱癌患者临床病理特征及生存预后有关。承丽萍等[21]报道,胃癌组织中miR-320a水平明显低于癌旁组织,miR-320a水平与淋巴结转移、肿瘤最大径有关,与本研究结果具有一致性。本研究多因素Cox回归分析显示,miR-124、miR-320a、TNM分期、淋巴结转移是膀胱癌患者生存预后的影响因素,而且Kaplan-Meier法分析表明,miR-124、miR-320a高水平患者3年累积生存率高于miR-124、miR-320a低水平患者,这与王适等[22]和董奇观等[23]的研究结果一致,提示血清miR-124、miR-320a对膀胱癌患者生存预后具有一定的评估价值,可作为评估膀胱癌患者生存预后的参考指标。

综上所述,膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a呈低水平,与TNM分期、肿瘤最大径、淋巴结转移有关,miR-124和miR-320a联合检测对评估患者生存预后具有重要价值。但是,本研究尚存在不足之处,如纳入的样本例数较少,样本范围单一等,而且关于miR-124、miR-320a影响膀胱癌的具体机制的研究较为缺乏,后续会采用多中心大样本试验,对本研究结果进行验证。