再生障碍性贫血患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平及临床意义

李娟娟,徐启革,张 淼

青岛市胶州中心医院:1.内分泌血液内科;2.病理科;3.呼吸内科,山东青岛 266300

再生障碍性贫血(AA)是一种因骨髓微环境和骨髓造血干细胞受损导致骨髓造血功能衰竭、全身血细胞数量减少的自身免疫性疾病,以青壮年多见,在我国发病率为万分之0.74[1]。AA患者常出现感染、贫血、出血等症状,根据疾病严重程度分为重型AA及非重型AA,重型AA起病急,病情严重,疾病发展迅速,非重型AA疾病严重程度容易控制,但部分患者久治无效,病程长达数十年,严重威胁患者生命健康和生活质量[2]。相关报道指出,AA发病机制主要为免疫机制异常[3]。miR-155-5p、miR-1260b均与AA的发生有关[4-5],通过有效的治疗可降低二者血清水平。本课题组推测外周血外周血miR-155-5p、miR-1260b水平与疾病严重程度及预后有关,但相关报道较少。为验证此推测,指导临床治疗,本研究选取108例AA患者和102例健康志愿者进行试验,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将本院2014年1月至2019年8月收治的初诊AA患者108例纳入研究作为观察组,男55例,女53例,年龄21～57岁,平均(36.7±6.3)岁,病程7 d至13个月,平均(7.3±1.0)个月。其中,重型AA 53例,非重型AA 55例。观察组所有患者均符合《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[6]中AA的诊断标准。另外,选取同期于本院体检的健康志愿者102例作为健康组,男52例,女50例,年龄22～56岁,平均(37.6±6.3)岁。排除标准:(1)合并严重心、肝、肾等原发疾病;(2)伴有心、肝、肾等重要脏器恶性肿瘤;(2)慢性高钠血症、应激性高血糖、糖尿病;(3)酗酒;(4)妊娠、哺乳期妇女。观察组和健康组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有受试者均对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准(伦理编号:201401A01)。

1.2方法

1.2.1外周血miR-155-5p、miR-1260b水平检测 观察组在纳入本研究次日(未接受治疗前)及治疗后,健康组在纳入本研究次日进行标本采集。于清晨空腹状态下取肘部静脉血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMNC),于-80 ℃冻存。采用总RNA抽提试剂(Trizol,北京索莱宝科技有限公司,批号120617115,规格100 mL)提取PBMNC中的总核糖核酸(RNA),采用紫外分光光度法(上海美谱仪器有限公司,型号为UV-1800)检测总RNA的纯度与水平。取20 μL总RNA,采用多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸[Oligo(dT)]利用反转录酶(厂家:北京赛尔瑞成生命科学技术有限公司,中国北京,批号:121025189A,规格:100 μL)反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),反转录反应条件为16 ℃ 30 min,42 ℃ 40 min,85 ℃5 min。再以cDNA为模板用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-155-5p、miR-1260b水平(PCR扩增仪由美国应用生物系统公司提供,型号为7300型),miR-155-5p引物:上游为5′-GTGGGTACTGCTATTCGTGCT-3′,下游为5′-GTCCGTGACGTGGCGTAG-3′;miR-1260b引物:上游为5′-GGCCTACCTACCACGTC-3′,下游为5′-GTCCGTGTGGTGGACTCG-3′;U6引物:上游为5′-GGTCGGCTGCACAGATACGA-3′,下游为5′-CGGTTCACTAAT TTCCGTGTGCT-3′。qPCR反应条件如下,95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃60 s,共40个PCR循环。以U6为内参物,采用2-ΔΔCt法计算miR-155-5p、miR-1260b的相对表达水平。

1.2.2治疗方法 (1)输血支持:输注红细胞、血小板,参照文献[7]。(2)分型治疗:非重型AA患者予以环孢素A(江苏九阳生物制药有限公司,批号131014HB,规格100 mg∶50 mL)联合雄激素(十一酸睾酮注射液,浙江仙琚制药股份有限公司,批号1307135682A,规格2 mL∶0.25 g)治疗;重型AA患者年龄≤35岁者采用人类白细胞抗原(HLA)相合同胞供者造血干细胞移植治疗,若HLA不匹配则采用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)[赛诺菲(北京)制药有限公司,中国北京,批号36190812AC,规格5 mL∶25 mg]联合环孢素A维持治疗,年龄>50岁者采用ATG联合环孢素A维持治疗,年龄>35～50岁者可采用与年龄≤35岁或年龄>50岁者相同的治疗方案,所有患者维持治疗期间若符合条件接受无关供者造血干细胞移植治疗[8]。(3)维持治疗:患者均续予以司坦唑醇(广西南宁百会药业集团有限公司,批号131012A,规格2 mg)联合环孢素A治疗6个月。随访1年。

1.3观察指标 所有患者均通过电话、门诊复查等方式随访,截至2022年12月份。比较观察组与健康组外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;比较重型AA患者、非重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;统计随访期间观察组死亡例数,计算病死率。病死率=死亡例数/观察组总例数×100.00%;比较死亡患者与存活患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;分析AA患者死亡的影响因素。

2 结 果

2.1健康组、观察组外周血miR-155-5p、miR-1260b水平比较 观察组外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于健康组(1.3±0.2vs.1.0±0.1、1.8±0.3vs.1.0±0.2,t=28.924、21.255,P<0.05)。观察组治疗后外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均低于治疗前(1.2±0.1vs.1.3±0.2、1.4±0.3vs.1.8±0.3,P<0.05)。

2.2重型AA患者、非重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平比较 重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于非重型AA患者(1.4±0.1vs.1.2±0.2、2.0±0.2vs.1.58±0.2,t=5.706、10.854,P<0.05)。

2.3观察组治疗效果观察 观察组治疗期间4例死亡,40例显效(治疗后Hb上升幅度≥30 g/L)、29例有效(治疗后Hb上升但上升幅度<30 g/L),35例无效(治疗后Hb未上升甚至下降)。

2.4外周血miR-155-5p、miR-1260b水平与AA患者死亡的关系 AA患者死亡45例(其中治疗期间死亡4例、随访期间死亡41例),病死率为42.86%。死亡患者与存活患者的性别、年龄、骨髓增生程度比较,差异无统计学意义(P>0.05);死亡患者中重型AA患者比例高于非重型AA患者(P<0.05),死亡患者并发感染、出血比例,淋巴细胞与非造血细胞比值,治疗前外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于存活患者(P<0.05),死亡患者的白细胞计数、网织红细胞均值、基线血小板计数均低于存活患者(P<0.05)。见表1。

表1 AA患者死亡与存活的单因素分析[n(%)或

单因素分析显示,临床分型为重型AA,并发感染、出血,正细胞正色素性贫血、白细胞计数、网织红细胞均值、淋巴细胞与非造血细胞比值、基线血小板计数,治疗前外周血miR-155-5p、miR-1260b水平、治疗无效均与AA患者死亡有关(P<0.05),将这些因素纳入多因素分析,发现上述因素及治疗后miR-155-5p、miR-1260b水平均是AA患者死亡的危险因素(P<0.05),见表2。

表2 Cox回归分析AA患者死亡的危险因素

3 讨 论

AA病因的复杂性和疾病本身的难治性导致该病病死率高[9]。尽管随着医疗与科技的进步,重型AA病死率得到有效控制,由90%降至30%以下[10],但仍对人类的生命健康有严重威胁。本研究中观察组病死率为42.86%,高于吴鸿飞等[11]报道的7.9%,可能与患者治疗方案、随访时间等差异有关。对AA患者死亡风险进行准确预测十分必要,但目前尚无公认的预测指标。

本研究结果显示,观察组外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于健康组,提示AA患者miR-155-5p、miR-1260b水平升高。miR-155是一个明星分子,参与机体免疫、造血、炎症等多种生命活动[12]。辅助性T细胞(Th)是T细胞的一个亚群,Th活化过程中,若miR-155表达增加,会促使Th0分化为Th1,导致Th1/Th2失衡,T细胞功能异常[13]。另有研究发现,在未分化的CD34+造血干细胞中miR-155呈现高表达,它严密调控人类造血干细胞髓系和红系细胞的分化,是维持机体正常造血功能的调节器[14]。miR-155-5p是miR-155的一个亚型,相关研究证实miR-155-5p在免疫反应等过程中充当重要角色[15]。本研究中AA患者miR-155-5p水平上升可能在Th1/Th2极化以及调控造血干细胞中发挥重大作用。miR-1260b被认为具有类似癌基因的功能,可通过抑制Wnt信号通路中具有抑癌作用的基因从而促进肾细胞癌的发展[16]。AA患者miR-155-5p、miR-1260b高水平可能通过协同作用调控T细胞凋亡,使T细胞功能下降,降低对B细胞的抑制作用,B细胞功能亢进而产生的大量自身抗体可会引起自身免疫病,从而促进AA患者骨髓造血障碍,加重其疾病严重程度,增大死亡风险。本研究还发现,观察组重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平高于非重型AA患者,死亡患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平高于存活患者,提示AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平与病情及预后有关,重型AA中二者水平更高。李峻等[17]的研究显示,重型AA和非重型AA患者miR-155-5p、miR-1260b水平均高于对照组人群,而且重型AA患者水平更高。相关研究结果显示,miR-1260水平可影响恶性肿瘤患者的生存率[18]。本研究结果与上述报道的结果一致,提示外周血miR-155-5p、miR-1260b水平可用于评价AA患者的病情、预测其死亡风险。另外,本研究还显示治疗前后外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均是AA患者死亡的危险因素,与上述报道及分析一致[17-18]。

本研究结果中,正细胞正色素性贫血、白细胞计数、网织红细胞均值水平、淋巴细胞与非造血细胞比值、基线血小板计数、并发感染、出血、无效均是AA患者死亡的影响因素,与既往相关研究报道一致[19-21]。正细胞正色素性贫血意味着骨髓造血功能受损;白细胞减少可引起感染,从而增加AA患者死亡的风险;网织红细胞均值降低意味着骨髓造血功能被抑制、病情重,可增加死亡风险;淋巴细胞与非造血细胞比值升高,T淋巴细胞功能亢进,导致造血组织损伤;AA患者出血与血小板计数减少、血小板功能下降有关,加重贫血症状、增加出血和死亡风险;AA患者并发感染会进一步抑制骨髓造血功能,造血干细胞增殖受到抑制,一些病毒、细菌侵袭感染导致中粒细胞难以生存,死亡风险升高;无效患者可因病情控制不理想导致死亡风险增高。

综上所述,临床分型为重型AA,并发感染、出血,正细胞正色素性贫血、白细胞计数、网织红细胞均值、淋巴细胞与非造血细胞比值、基线血小板计数,外周血miR-155-5p、miR-1260b水平,治疗无效均是AA患者死亡的影响因素。外周血miR-155-5p、miR-1260b水平可作为AA患者严重程度及预后评估的指标。另外,由于本试验持续时间长、所选病例时间较早等,患者的治疗方案与2022版《再生障碍性贫血诊断与治疗中国指南》[22]有出入,会影响研究结果,后续应更新治疗方案探讨该问题,以期更好地服务于临床。