γ-分泌酶组件NCT在痴呆小鼠中枢神经系统的分布及表达

龙志敏 赵 蕾 贺桂琼 宋 冲 楚亚楠

(重庆医科大学神经科学研究中心，重庆 400016)

β淀粉样蛋白(beta-Amyloid protein，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques，SP)是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型病理特征之一。Aβ来源于脑内β-分泌酶和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)跨膜区的切割。Aβ主要有两种形式:Aβ40和Aβ42(二者比例为9∶1)，其中Aβ42容易纤维化聚集形成具有毒性的低聚体，Aβ42产生过多极易导致SP的形成以及AD的发生。由于γ-分泌酶是催化Aβ生成的终末阶段，且是决定Aβ40/Aβ42比例的关键酶，因此该酶目前已成为AD的潜在性治疗靶点〔1〕。现已证实γ-分泌酶是由早老素(Presenilin，PS)、前咽缺陷蛋白(Aph-1)、早老蛋白增强子2(Pen2)和单过性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)四种蛋白亚基构成的一种多蛋白复合体〔2〕，其中PS是γ-分泌酶的活性中心〔3〕，但PS活性受γ-分泌酶其他组分的调控，其中最为密切的是NCT〔4〕。本文以不同发育阶段的APP/PS1双重转基因AD模型小鼠和同窝野生型小鼠为研究对象，采用形态学方法系统研究NCT在中枢神经系统(CNS)的分布与表达，以期进一步明确NCT的功能及与AD的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 APP/PS1双重转基因传代小鼠的建立 将购于Jackson Lab雄性和雌性的APP/PS1双转基因杂合体种鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85Dbo/J合笼，交配繁殖。产下的后代用PCR进行基因分型。

1.1.2 试剂 兔抗NCT多克隆抗体(Convance公司);鼠抗PS单克隆抗体(abcam公司);小鼠抗Aβ单克隆抗体:靶向Aβ1～17的6E10，靶向Aβ17～24的4G8(Sigma公司);鼠抗 β-actin 单克隆抗体(Santa Cruz公司);羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoreseach Laboratories，USA);DNA提取试剂盒(Tiangen公司);链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体(SABC)免疫组化试剂盒(北京中杉);二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(Pierce，USA);其他均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 对APP/PS1双重转基因小鼠进行鉴定。剪子代小鼠鼠尾约0.5 cm，按照试剂盒(Tiangen公司)步骤提取基因组DNA，核酸蛋白测定仪测定浓度后进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察同时出现APP、PS1条带的即为APP/PS1双转基因小鼠。PCR扩增:根据提供的引物扩增APP和PS1，以β-actin为内对照。APP引物上游:5'-CACCACAGAATCCAAGTCGG-3'，下游:5'-CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC-3';PS1引物上游:5'-CAGGTGCTATAAGGTCAT-3'，下游:5'-ATCACAGCCAAGATGAGC-3';β-actin 引物上游:5'-GACAGGATGCAGAAGGAGAT-3'，下 游:5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3'。PCR 反应条件:94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→58℃ 40 s→72℃ 40 s)共35个循环→72℃ 10 min(－20℃保存PCR产物)。APP基因PCR产物长350 bp，PS1扩增片段长608 bp，β-actin 为446 bp。

1.2.2 动物分组及处理 根据基因分型结果，APP/PS1基因阳性小鼠为AD模型组，同窝野生型小鼠为对照组。设置5个观察时间点，分别为出生后 1 d、7 d、21 d、90 d和 180 d，记为P1、P7、P21、P90、P180。

1.2.3 免疫组织化学染色 小鼠腹腔注射2%水合氯醛麻醉成功后开胸，经心脏灌注4%多聚甲醛固定后，取脑入多聚甲醛后固定8 h，常规脱水透明石蜡包埋，然后分别进行冠状和矢状切片，厚度4μm。切片经二甲苯脱蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，微波煮沸抗原修复，自然冷却，再经3%H2O2处理15 min以封闭内源性过氧化物酶活性，5%胎牛血清(BSA)封闭1 h后，加入Ⅰ抗，4℃过夜。Ⅱ抗和SP复合物于室温孵育2 h。最后用DAB显色。常规脱水、透明、封片，光镜下观察。

1.2.4 免疫荧光双标 切片脱蜡后，经PBS冲洗3次，然后放入含0.3%TritonX-100的PBS中，室温浸泡30 min，再用PBS冲洗3次，5%正常山羊血清室温封闭1 h，然后加入Ⅰ抗:兔抗NCT抗体 (1∶200)及小鼠抗 PS1单克隆抗体(1∶1 000);或兔抗NCT抗体 (1∶200)及小鼠抗Aβ抗体6E10(1∶50)，孵育24 h(4℃)，PBS冲洗3次;加入Ⅱ抗:山羊抗兔 FITC(1∶400)和山羊抗小鼠TRITC(1∶400)，室温孵育2～4 h;PBS冲洗;甘油封片。激光共聚焦荧光显微镜(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.)观察并采图。阴性对照:免疫组化和免疫荧光染色时，用正常山羊血清代替I抗孵育APP/PS1转基因小鼠和野生型小鼠脑切片，经上述免疫组织化学和免疫荧光染色，未见明显的特异性免疫阳性反应产物。

2 结果

2.1 APP/PS1双转基因痴呆小鼠的鉴定结果 雌性和雄性种鼠产下后代，剪鼠尾提取基因组DNA经PCR扩增后，1.5%琼脂糖电泳结果:同时出现 APP条带(350 bp)和 PS1条带(608 bp)的即为APP/PS1双转基因阳性小鼠。见图1。

2.2 NCT在成年APP/PS1双转基因痴呆小鼠CNS各区域的分布 取出生后180 d的APP/PS1双转基因痴呆小鼠脑和脊髓进行免疫组化，结果显示:NCT阳性细胞广泛分布于成年痴呆小鼠CNS各区域，包括大脑新皮质、嗅脑、海马、丘脑、纹状体、小脑、脑干和脊髓等，其中NCT阳性反应主要出现在神经元，而未出现在胶质细胞内。痴呆小鼠大脑新皮质的NCT阳性细胞主要分布于第Ⅳ、V层，而表层(I层)出现的NCT阳性细胞少;嗅脑内的NCT阳性细胞主要分布于内皮层的第Ⅱ层;海马内的NCT阳性细胞主要出现在锥体细胞和颗粒细胞层;中脑黑质区域出现NCT强阳性反应;隔区有中等强度的NCT阳性反应;纹状体和丘脑内仅呈弱阳性表达;小脑内的NCT阳性反应以Purkinje细胞层表达较多，颗粒细胞层表达较弱;脑桥和延髓内的神经核团(尤其是运动核)内NCT表达非常明显;第三、四脑室及侧脑室脉络丛出现NCT强阳性表达;在脊髓灰质前角、后角和侧角及灰白质交界的网状结构内NCT呈强阳性表达，而白质区域几乎未见NCT阳性细胞。见图2。

图1 APP/PS1双转基因小鼠的基因分型电泳图

2.3 NCT的分布与SP及Aβ分布的关系 免疫组化结果显示，出生后180 d的成年痴呆小鼠CNS内出现大量SP，其大小和形态不一，但染色较均匀。其中痴呆小鼠大脑新皮质和海马内SP体积大、数量多、密集分布;脑室脉络丛内可见较多的阳性斑块;小脑皮质内可见少量散在的SP分布;但脑干和脊髓内未见SP。见图3。为弄清细胞内NCT与Aβ是否共存，实验中取成年痴呆小鼠的脑组织进行了免疫荧光双标。结果显示:痴呆小鼠脑部各区均出现大量NCT阳性细胞(绿色荧光)和Aβ阳性细胞(红色荧光)，但在大脑皮质和海马内NCT阳性神经元的数量要多于Aβ阳性细胞，且在一些神经元内NCT与Aβ出现了共存。见图4。

2.4 NCT与PS1在成年痴呆小鼠脑组织中的共存 免疫荧光双标结果显示:PS1在成年APP/PS1双转基因痴呆小鼠脑组织的分布趋势同NCT的分布高度一致。不同的是，在神经元内PS1免疫阳性物在胞浆中表达较强，而NCT免疫阳性物在胞浆、胞膜均有强表达。见图5。

图2 NCT在APP/PS1双转基因小鼠CNS各区域的分布

图3 SP在APP/PS1双转基因小鼠CNS各区域的分布(×100)

图4 免疫荧光双标显示

图5 免疫荧光双标显示

2.5 NCT在不同发育阶段痴呆小鼠及同窝野生型小鼠脑内的动态分布情况 出生后1 d(P1)的痴呆小鼠和同窝野生型小鼠大脑皮质内NCT阳性神经元排列致密，免疫阳性物质主要分布于神经元胞体，包括细胞膜、细胞质、核膜和突触;随着小鼠的发育，脑组织单位面积内NCT阳性神经元数量逐渐减少，一部分NCT逐渐被运输到神经元的树突和神经纤维网中，NCT免疫阳性物质主要分布于细胞膜、部分细胞质和突起，细胞膜染色较深，细胞质染色较浅。与各年龄段野生型小鼠相比，痴呆小鼠脑内NCT阳性神经元的染色深度明显高于野生型小鼠且痴呆小鼠脑内NCT免疫阳性物质在整个胞质和突触的分布更明显。见图6。

图6 NCT在不同年龄段APP/PS1双转基因及同窝野生型小鼠脑中分布及表达的比较(×400)

3 讨论

NCT是2000年YU〔5〕等在纯化PS片段时分离出的一种与γ-分泌酶功能和 Aβ产生有关的重要蛋白质。近期研究发现〔6～8〕，NCT 缺乏会使 γ-分泌酶活性下降、Aβ 产生减少;过度表达的NCT可增加Aβ的生成;NCT胞外功能区DYIGS基序的人工缺失及人工诱导的突变产物会使Aβ尤其是Aβ42明显增多。以上研究提示，NCT的结构变异或表达水平的改变将导致Aβ生成量的异常，可能与AD的发生发展密切相关。AD可分为家族性(FAD)和散发性(SAD)两种，FAD主要是常染色体显性遗传病，仅占全部AD的10%以下，目前已证实APP和PS的突变是引起FAD的主要原因;其余绝大多数AD属散发性，由多因素引起。本实验采用的是APPswe/PS△E9双转基因小鼠模型，APPswe是“瑞典家族”突变，突变发生在APP编码序列末端，670、671位点，Lvs与 Met分别被 Asn与 Leu取代;PS△E9是在FAD中发现的第9外显子缺失突变。携带APPswe和PS1突变基因的小鼠具有AD患者的特征性改变，包括空间学习和记忆障碍、SP沉积、神经元丢失及反应性胶质细胞增生，被认为是理想的AD动物模型。

目前关于AD的发病机制形成了几种学说，其中较为公认的是“Aβ学说”，该学说认为Aβ产生过多并沉积是引起AD的中心环节。Aβ是由APP经β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶相继作用后产生。据文献报道〔9～11〕，无论是AD患者还是转基因AD模型鼠脑内均出现了BACE1蛋白水平增多、β-分泌酶活性增强，但是否出现γ-分泌酶表达及活性的改变尚未见文献报道。γ-分泌酶是唯一负责I型跨膜蛋白(如APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4等)延伸序列的细胞膜内分裂的膜连蛋白。在γ-分泌酶复合体的四个组件蛋白，第一个被发现且研究得最透彻的是PS。目前已证实PS1水解生成的PS1 CTF/NTF异二聚体是γ-分泌酶的催化活性中心，PS1的异常突变是引起家族性AD的主要原因。γ-分泌酶中第二个被发现且与PS1关系最密切的蛋白亚基是NCT，有证据显示，NCT上有γ-分泌酶的底物结合位点〔12〕，参与 γ-分泌酶与底物的选择性结合;最近研究还发现，NCT的胞外功能区可识别和结合γ-分泌酶的底物，被称为γ-分泌酶的底物受体〔13〕。作为γ-分泌酶结合位点兼底物受体的NCT，其表达水平变化势必影响底物(如sAPP)进入γ-分泌酶的数量，进而影响产物(如Aβ)的产量。可以预见，通过有选择性的调节NCT的表达水平来调控γ-分泌酶活性及Aβ的生成量，有望缓解AD症状，达到治疗AD的目的。尽管目前国际上对NCT的研究在分子水平取得了不少进展，但关于NCT在AD患者CNS中的分布及表达、NCT的分布与SP及Aβ分布的关系、NCT在AD患者及正常人脑组织中的分布和表达的差异等形态学方面的研究却鲜有报道。

NCT主要由成纤维细胞和神经元合成，在体内广泛分布。Hebert等〔14〕发现小鼠不同组织中 NCT mRNA的表达水平不同。NCT在小鼠肝脏、心脏、肾脏和睾丸中表达最高，骨骼肌表达最少，在脑中表达水平一般，但NCT在CNS各区域分布的情况如何尚无可知。本实验取出生后6个月的成年APP/PS1双转基因AD模型小鼠的脑和脊髓进行免疫组化染色，结果发现，NCT广泛分布于痴呆小鼠脑和脊髓的各个区域，但不是均匀分布，其中NCT阳性神经元在大脑新皮质的第Ⅳ～V层、内嗅皮质第Ⅱ层和海马的锥体细胞和颗粒细胞层的分布最密集;其次在中脑黑质区域、隔区、纹状体、丘脑、小脑皮质Purkinje细胞层、脑桥和延髓内的神经核团(尤其是运动核)、各脑室脉络丛及脊髓灰质等有较多分布，这一结果与Kodama等〔15〕观察到的NCT在正常小鼠CNS各区域分布的结果相似。

与NCT在CNS各区域的分布相比，神经元外的SP在出生后6个月的成年痴呆小鼠CNS中的分布极为局限，主要选择性分布于大脑新皮质、内嗅区及海马等与学习记忆密切相关的区域，在侧脑室脉络丛及小脑皮质有极少量的分布，而脑干及脊髓内未见SP。既然NCT的分布比细胞外Aβ沉积的范围广，那么，在大脑皮质与海马区域，NCT是否与神经元内的Aβ共存?实验中通过免疫荧光双标发现，在大脑皮质和海马，NCT阳性神经元的数量仍较Aβ阳性神经元的数量多，几乎所有Aβ阳性神经元能与NCT阳性神经元叠加，即神经元内的Aβ与NCT出现了共存，但有一部分NCT阳性神经元内并未出现Aβ，提示这部分NCT可能未参与Aβ的生成，即NCT除与Aβ的生成、AD的发生有关外，尚存在其他功能。在γ-分泌酶“四人家庭成员”中，NCT和PS1的关系尤为密切。已有不少研究以正常大鼠或细胞为研究对象，用分子生物学方法观察到NCT与PS1之间形成了NCT-PS1复合物，且NCT的成熟依赖于PS1〔3〕，那么，在痴呆小鼠脑内，NCT与PS1在分布上有怎样的关联呢?本实验发现PS1在痴呆小鼠脑中的分布趋势同NCT的分布高度一致，只是在神经元内的分布，PS偏重在胞质表达，而NCT在胞质、胞膜均有表达，且二者在神经元内共存。

为弄清NCT在痴呆小鼠与正常小鼠脑组织中的分布及表达是否存在差异，实验中取不同发育阶段的APP/PS1双重转基因痴呆小鼠及同窝野生型小鼠的脑组织进行了免疫组化，结果发现，无论是痴呆型还是野生型，新生小鼠脑内的NCT阳性神经元在大脑皮质的分布密集;随着小鼠的发育，单位面积内NCT阳性神经元数量逐渐减少。不同的是，无论在哪一个年龄段，痴呆小鼠脑神经元内的NCT免疫阳性物不仅见于细胞膜和突起，更显著的是较多的NCT还分布于整个胞质，即细胞膜和细胞质均浓染;而同窝野生型小鼠脑神经元内的NCT主要分布于细胞膜周围，故细胞膜周围染色较深，而胞质染色极浅甚至不着色。该现象提示，NCT在痴呆小鼠和正常小鼠脑神经元内的分布及表达存在差异，那么，这种差异是否与痴呆小鼠脑组织中Aβ的生成有关呢?已有研究表明，NCT最初在内质网中合成，然后向高尔基复合体及细胞膜等转运。正常情况下，绝大多数NCT分布于高尔基体外侧网络(Trans-Golgi Network，TGN)，即靠近细胞膜分布;少量分布于内质网、溶酶体、线粒体等位于胞浆内或靠近核膜的细胞器〔16〕。近期研究发现〔7〕，NCT在亚细胞水平的分布会影响不同形式Aβ的产生:细胞膜富含NCT的细胞主要产生分泌型Aβ，其中以Aβ40为主;而若细胞的线粒体、TGN和溶酶体所含的NCT突变或表达水平增加，则导致细胞内Aβ的产生以Aβ42为主，成为形成SP的罪魁祸首。根据本实验的结果，结合相关的文献报道，推测NCT在痴呆小鼠和正常小鼠脑神经元内分布及表达的差异与Aβ的生成及AD的发生密切相关。但NCT在两种小鼠脑内的分布及表达为什么会出现这种差异，是由于NCT在合成过程中出现了错误折叠、转运障碍还是NCT的蛋白降解出现了障碍?关于这些问题有待进一步探讨。

综上，本实验通过形态学方法发现，NCT在成年痴呆小鼠CNS各区域广泛分布，但在大脑皮质和海马内的分布最密集;NCT的分布范围要远远比Aβ沉积的范围广;在不同发育阶段的痴呆小鼠和同窝野生型小鼠脑内，NCT的表达和分布出现了差异，这种差异可能与Aβ的生成及AD的发生有关。

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