Bcl-2、Bax及caspase-9在鼻息肉组织中的表达变化

徐 芬，康 健，陈 冬，马晓峰

(辽宁医学院附属第一医院耳鼻喉科，辽宁锦州121001)

鼻息肉(nasal polyps，NPs)是耳鼻咽喉科的常见病及多发病，主要表现为鼻-鼻窦黏膜的慢性病变，组织病理学特点为高度水肿的鼻-鼻窦黏膜，黏膜下血管及间质增生，腺体分泌活跃及炎性细胞浸润。至今鼻息肉的病因及发病机制尚不明确，相关研究认为鼻息肉的发生与感染、过敏、纤毛形态结构和功能异常、微环境的改变、嗜酸粒细胞及细胞因子的增生有关，其中细胞因子在鼻息肉发病机制中的作用越来越受到人们的关注，近年来的研究甚多，主要集中在促进细胞增殖的细胞因子，而细胞凋亡的研究相对较少，本研究通过研究3 种重要的细胞凋亡相关因子Bcl-2，Bax 及caspase-9，从基因和蛋白两个水平来探讨细胞凋亡在鼻息肉发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本采集:鼻息肉组织来源于辽宁医学院附属第一医院2012年01月至2013年10月接受手术的鼻息肉患者共41 例，男24 例，女17 例。年龄31～77 岁，平均54 岁。下鼻甲黏膜组织来源于慢性鼻炎的患者共26 例，男17 例，女9 例。年龄22～68 岁，平均45 岁。所有患者在手术前均详细了解病情，所取组织标本均经患者及家属同意后签署知情同意书。手术取下的新鲜标本部分立即投入－270 ℃的液氮中保存，留做RT-PCR 反应用，一部分用甲醛固定48 h，石蜡包埋，做4 μm 切片。

所有患者术前2 周内均未使用过皮质类固醇等药物，变应原皮肤点刺和血清特异性IgE 检查结果为阴性，1年内有鼻息肉手术及6 个月内有鼻窦急性反应或上呼吸道感染者被排除外。

1.2 方法

1.2.1 Real-time qRT-PCR:用Trizol 法提取总DNA，分光光度计测A260/A280的比值(平均＞1.8)，并定量。取0.5 μg 总RNA 按PrimeScript RT 反转录试剂盒说明反转录生成cDNA，以β-actin 为内参，使用ABI7900HT real time PCR 荧光定量PCR 仪，通过二步法SYBP Green 实时荧光定量PCR 技术扩增目的基因。PCR 扩增:第一步:95 ℃30 s，一个循环;第二步:95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。每个标本均绘制熔解度曲线。使用公式y=2－ΔΔCt对目的基因进行相对定量。

1.2.2 免疫组化部分:石蜡切片用SP 法按照试剂盒说明分别进行Bcl-2，Bax 及caspase-9 免疫组化染色，以胞质中出现棕黄色颗粒的阳性反应产物。每张切片在高倍显微镜下(×400)随机选择5 个视野，取平均值作为该标本的阳性细胞率。每张切片均经2 位病理科医师进行单盲法评估。

1.3 统计学分析:所有数据均用SPSS16.0 统计软件处理。qRT-PCR 结果应用t 检验进行统计学分析，免疫组化结果应用χ2检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 免疫组化:结果显示鼻息肉中可见较多的Bcl-2 和Bax阳性细胞，大部分聚集在鼻息肉的上皮层及血管腺体周围，而对照组中阳性表达较少，细胞核多呈蓝色;而鼻息肉中caspase-9 表达为弱阳性，主要聚集在间质细胞中，而对照组中阳性细胞较多，明显高于鼻息肉组(图1，2，3)。

图1 Bcl-2 蛋白在两组中的表达Fig 1 The expression of Bcl-2 protein in two groups

2.2 鼻息肉组和对照组中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表达结果及免疫组化阳性率结果(表1，2)。

图2 Bax 蛋白在两组中的表达Fig 2 The expression of Bax protein in two groups

图3 Caspase-9 蛋白在两组中的表达Fig 3 The expression of caspase-9 protein in two groups

表1 鼻息肉组和对照组中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表达结果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

表1 鼻息肉组和对照组中Bcl-2、Bax、caspase-9 mRNA 的表达结果Table 1 The Bcl-2，Bax and caspase-9 mRNA expression level in different groups(±s，n=67)

＊P＜0.05 compaired with control.

groupBcl-2Baxcaspase-9 control1.65 ±0.201.14 ±0.181.18 ±0.17 NPs4.02 ±0.62*1.94 ±0.38*0.84 ±0.06*

表2 鼻息肉组和对照组中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫组化阳性率结果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

表2 鼻息肉组和对照组中Bcl-2、Bax、caspase-9免疫组化阳性率结果Table 2 The positive expression rate of Bcl-2，Bax，caspase-9 in different groups［±s(%)，n=67］

＊P ＜0.05 compaired with control．

groupBcl-2Baxcaspase-9 control38.46 ±1.2946.15 ±1.9142.31 ±1.20 NPs87.80 ±2.32*75.61 ±2.07*24.39 ±1.02*

2.3 Bcl-2 在鼻息肉中的表达与bax 表达的相关性:鼻息肉组织中Bcl-2 的表达与bax 的表达存在正相关趋势(P＜0.05)。

3 讨论

鼻息肉的病因至今仍不明确，大多数研究提示鼻息肉的发病与鼻及鼻窦黏膜的过度增生有关，促进鼻息肉增生的细胞因子多达几十种，但是有关细胞凋亡在鼻息肉中的研究较少［1］。本实验结果Bcl-2 在鼻息肉中绝大多数表达阳性，鼻息肉组织中Bcl-2 与Bax 阳性表达率的比值为1.16，说明鼻息肉细胞中细胞凋亡受到抑制，而鼻息肉中caspase-9 表达水平较低，鼻息肉组织中细胞凋亡信号传导受到抑制。

目前鼻息肉的治疗主要集中在手术切除和类固醇激素的使用，对于长期使用激素，即使是低剂量局部应用，激素的不良反应也同样引起人们的重视，目前低剂量局部应用氨甲喋呤(MTX)治疗鼻息肉，尤其是激素依赖型鼻息肉的患者，取得一定的疗效［2］，甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中作用机制与caspase 级联反应和线粒体介导的细胞凋亡密切相关［3］，本研究的实验结果为甲氨蝶呤(MTX)在鼻息肉中的治疗提供了一定的理论依据，同时为探讨鼻息肉的病因及治疗提供了新的思路。细胞凋亡是极为复杂的生理过程，随着细胞凋亡相关研究的深入，对鼻息肉的发病机制及治疗提供帮助。

［1］张海令，许安廷，范献良.鼻息肉中LIVIN、SMAC 的表达及其意义［J］.山东大学学报，2012，50:0112-0114.

［2］Buyukozturk S，Gelincik A，Aslan I，et al.Mehotrexate:can it be a choice for nasal polypsis in aspirin exacerbated respiratory disease［J］.Asthma，2009，46:1037-1041.

［3］Cho HW，Park SK，Heo KW，et al.Methotrexate induces apoptosis in nasal polyps via caspase cascades and both mitochondria-mediated and p38 mitogen-activated protein kinases/Jun N-terminal kinase pathways［J］.Am J Rhinol Allergy，2013，27:26-31.