毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取工艺*

计玮玮，俞婷婷，李 颖**，朱 炜，沈晓利，王勇军

（1.湖州市梁希森林公园管理处，浙江 湖州 313022；2.湖州市生态林业保护研究中心，浙江 湖州 313013；3.长兴县林业技术推广中心，浙江 湖州313199）

竹荪（Dictyophora indusiata）属鬼笔科（Phauaceae）竹荪属（Dictyophora），别名竹笙、竹参，外形优美，营养丰富，有“菌中皇后”的美称[1-2]。竹荪具有补气养阴、润肺止咳、清热利湿的功效。其子实体中富含黄酮、多糖、多酚等生物活性物质，并含有多种氨基酸及多种维生素，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等作用[3-4]。黄酮类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性功能[5-6]。黄酮类化合物常采用乙醇等有机溶剂进行提取，也可采用超声波、微波等设备加以辅助提取[7]。

浙江省是全国重点毛竹（Phyllostachys edulis）主产区，近年来，随着浙江省毛竹林高质量发展提升工程的实施，毛竹林下栽培竹荪等食用菌模式在浙江省毛竹林区推广迅速。在毛竹林下人工栽培竹荪，不与粮争田，不与果争地，是林下经济产业的重要组成。在收获竹荪的同时，栽培后的废料又可以作为林地的天然有机质肥料，有效改善林中土壤结构和肥力，实现林-菌生态循环技术模式，是集经济效益、生态效益和社会效益于一体的短平快山区经济发展项目。

以毛竹林下人工栽培的竹荪子实体为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面优化法对毛竹林下栽培的竹荪子实体总黄酮的提取工艺条件进行优化。研究毛竹林下栽培竹荪中总黄酮的高效提取方法，有益于提升竹荪附加值，可为毛竹林下仿野生生态栽培竹荪的精深加工和开发利用提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

竹荪子实体，浙江省湖州市毛竹林下栽培；芦丁标准品（纯度≥98%），NaOH、Al（NO3）3、NaNO2等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

JDS-82A电热恒温振荡水槽，常州金坛精达仪器制造有限公司；R-210型旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司；紫外分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线绘制

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定总黄酮含量[8]。精密称取105℃真空干燥至恒重的芦丁标准品25 mg，用70%乙醇将其溶解并定容至50 mL，摇匀，得0.5 mg·g-1的芦丁标准液。分别精密移取上述标准液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于50 mL容量瓶，加2 mL~4 mL蒸馏水，加5%的亚硝酸钠0.4 mL，摇匀，放置6 min。加入10%的硝酸铝0.4 mL，摇匀，放置6 min。加入4%的氢氧化钠4.0 mL，再加蒸馏水至刻度、摇匀，放置15 min。以空白试剂作对比参照，在510 nm处测定吸光度，以质量浓度C（μg·mL-1）为横坐标、吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮的提取

将收集的毛竹林下栽培竹荪子实体真空烘干后粉碎，过40目筛，得毛竹林下栽培竹荪子实体粉末。准确称取2.0 g毛竹林下栽培竹荪子实体粉末置于磨口锥形瓶中，按照要求加入一定量的乙醇溶液，在一定温度下回流提取2 h。抽滤用80%乙醇定容至100 mL，取1.5 mL待测液于100 mL容量瓶中，按照测定芦丁标准液吸光度的步骤测定吸光度A。毛竹林下栽培竹荪子实体中总黄酮提取量（Q，mg·g-1）的计算公式为：

式中：ρ为待测液浓度（mg·mL-1）；n为提取液稀释因子；V为提取液体积（mL）；W为原料质量（g）。

1.3.3 提取条件的单因素试验

称取适量干燥粉碎后的毛竹林下栽培竹荪子实体2.0 g，选取提取温度、乙醇体积分数、料液比3个影响因素进行单因素试验设计。以总黄酮提取量为判断标准，按照1.3.2中的方法进行提取。固定提取温度为60℃，液料比为30∶1，分别在不同乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）条件下回流提取1 h，研究不同乙醇体积分数对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响；将液料比设置为30∶1，乙醇体积分数设置为70%，并分别在以下温度梯度下（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）进行回流提取1 h，探究不同提取温度对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响。将乙醇体积分数和提取温度分别设置为70%和60℃，分别在以下液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）下回流提取1 h，研究溶液中不同液料比对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响。试验数据取3组重复试验的平均值。

1.3.4 响应面法分析试验

在单因素试验数据分析的基础上，采用响应面设计里的Box-Behnken中心组合试验设计原理，最适水平范围选定提取温度、液料比、乙醇体积分数3个因素综合确定的范围，并运用Design Expert 8.05软件对试验数据进行全面的分析，响应面设计选取3因素3水平。自变量试验水平以-1，0，1分别进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验设计各因子及其水平Tab.1 Factors and its levels of response surface experimental design

2 结果与分析

2.1 总黄酮提取工艺

2.1.1 单因素试验结果

不同提取温度对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响结果见图1。

图1 提取温度对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由图1可知，在其他因素不变的前提下，在温度为40℃~70℃范围内，随着提取温度升高，总黄酮提取量逐渐增大，在70℃时总黄酮提取量达到最高；之后随着提取温度进一步升高，总黄酮提取量开始下降。这可能是由于黄酮类物质是一类对温度敏感的化合物，温度过高会引起部分总黄酮类物质结构分解、破坏，或溶液中的其他杂质溶出量增大，从而导致总黄酮类物质的提取量下降[9]。综合考虑，工艺优化试验中提取温度参数采用60℃、70℃、80℃作为响应面分析中该因素的3个水平。

不同乙醇体积分数对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响结果见图2。

由图2可知，在其他因素不变的前提下，乙醇体积分数在50%~80%时，随着体积分数的不断增加，总黄酮提取量逐渐升高，总黄酮提取量在乙醇体积分数为80%时达到峰值；而后随着乙醇体积分数进一步增加，总黄酮提取量开始呈下降趋势。原因可能是随着乙醇体积分数的逐渐增加，极性减小，溶液中其他亲脂性物质等杂质溶出率也随之增大，黄酮类物质竞争性结合乙醇-水分，从而影响了总黄酮的溶出[10]。综合考虑，工艺优化试验中乙醇体积分数参数采用70%、80%、90%作为响应面分析中该因素的3个水平。

图2 乙醇体积分数对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

不同液料比对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响结果见图3。

图3 液料比对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由图3可知，在其他因素不变的条件下，液料比在20∶1~30∶1，随着比例的不断升高，总黄酮提取量逐渐增大；当液料比达到30∶1后，随着液料比的进一步升高，总黄酮提取量变化较小。综合提取提取量、提取溶剂成本等因素考虑，为减少过滤时间及溶剂浪费，工艺优化试验中液料比参数采用25∶1、30∶1、35∶1作为响应面分析中该因素的3个水平。

2.1.2 响应面设计试验结果及分析

1）响应面试验结果

根据试验设计方案，选择提取温度（A）、乙醇体积分数（B）、液料比（C）作为自变量，以毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量作为响应值设计响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验结果Tab.2 Results of response surface methodology

对表2试验数据进行分析，使用Design Expert 8.05软件得到总黄酮提取量与乙醇体积分数、提取温度和液料比各因子的多元二次回归方程，进而获得以总黄酮提取量为指标的二次多项回归模型为：

该回归方程的相关系数R2为0.959 8。

对上述方程进行方差分析，结果见表3。

从表3结果分析可知，回归方程中以总黄酮提取量为目标函数，其回归效果均达到极显著水平（P＜0.01）；模型决定系数R2的数值为0.959 8，结果可说明该模型能较好地与实际试验相拟合；校正决定系数R2adj的数值为0.936 5，结果证明该模型能说明93.65%响应值的变化；失拟项中P值为0.888 6，P值大于0.050 0说明模型的失拟项不显著；依照显著性分析结果，提取温度（A）、乙醇体积分数（B）对响应值影响显著（P＜0.05），总黄酮提取量受AA、BB、CC以及AC的交互项影响显著（P＜0.05）。影响总黄酮提取量因素的大小顺序依次为：提取温度（A）＞乙醇体积分数（B）＞液料比（C）。

表3 试验结果方差分析Tab.3 Analysis of variance of experimental results

2）响应曲面图结果与分析

依据拟合的响应曲面形状，探讨提取温度、液料比及乙醇体积分数对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量的影响。将提取温度、液料比及乙醇体积分数分别以0水平固定在模型中，从而获得另外2个因素的交互影响结果[11]。二次回归方程的响应面及其等高线见图4～图6。

由图4～图6可知，提取温度（A）是对毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮提取量影响最显著的因素，极值条件在等高线的圆心处，体现在响应面有较大的弧度变化，其次是乙醇体积分数（B）。液料比（C）响应面变化弧度迂缓，说明其影响响应值的效果不明显。交互效应的强弱可利用等高线的形状来反映，如二因素交互作用显著，则呈椭圆形，反之则为圆形。因此，提取温度（A）与液料比（C）之间对总黄酮提取量的交互作用影响比较明显。

图4 提取温度和乙醇体积分数对总黄酮提取量的交互影响Fig.4 Interaction of extraction temperature and ethanol concentration on the yield of total flavonoids

图6 提取温度和液料比对总黄酮提取量的交互作用Fig.6 Interaction effect of extraction temperature and liquidsolid ratio on the yield of total flavonoids

图5 乙醇体积分数和液料比对总黄酮提取量的交互作用Fig.5 Interaction effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.3 验证试验

采用Design-Expert 8.05软件进行分析，利用Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，可获得其最佳提取条件：提取温度为74.5℃，乙醇体积分数为76.1%，液料比为31.1∶1，理论上总黄酮提取量可达43.61 mg·g-1。

根据最佳提取条件进行3次平行试验，测得总黄 酮 提 取 量 分 别 为42.78 mg·g-1、42.83 mg·g-1、42.76 mg·g-1。总黄酮提取量的实际平均值可达42.79 mg·g-1，是回归模型预测理论值的98.12%，这一结果说明试验结果与模型预测值拟合较好。

3 结论

通过毛竹林下仿野生生态栽培的竹荪，其品质与野生竹荪相近。目前传统的毛竹经营效益不佳，林农生产经营毛竹的积极性不大。通过毛竹生产与林下竹荪栽培相结合，可以最大程度提高毛竹林下的生产潜力，增加林农的经济收入，促进乡村振兴。采用总黄酮提取量作为考察指标，Box-Behnken响应面法分析提取温度、乙醇体积分数、液料比3个因素的影响，拟合出二项式数学模型，方差分析表明，提取温度、乙醇体积分数对总黄酮提取结果影响显著。对工艺条件进行优化和预测，在优化的工艺条件下，平行重复试验3次，得到的真实值与预测值基本吻合。通过响应面试验设计，优化得出毛竹林下栽培竹荪子实体总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取温度74.5℃，液料比31.1∶1，乙醇体积分数76.1%，该条件下总黄酮提取量为42.79 mg·g-1。该工艺为毛竹林下栽培的竹荪中活性物质的提取及精深加工提供依据。