陈酿前添加咖啡酸对干红葡萄酒颜色品质及多酚构成的影响

曹 鹏 张 波 张欣珂 刘月 何 非 段长青*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 葡萄与葡萄酒中心 北京100083 2 农业部葡萄酒加工重点实验室 北京100083 3 甘肃农业大学食品科学与工程学院 葡萄与葡萄酒工程学重点实验室 兰州730070）

颜色是红葡萄酒重要的感官品质，可反映葡萄原料和酿造工艺的优劣，也是影响消费者评判葡萄酒质量与消费的关键[1-2]。葡萄酒中花色苷的含量、种类决定了酒体的色泽特征和陈酿潜力[3]。然而，游离花色苷易受外界环境影响而降解，使得我国部分产区特别是产业规模较大的新疆、宁夏等西部产区，存在着红葡萄酒颜色稳定性差，陈酿期短等问题。

花色苷与辅色素进行辅色化作用，具有增强葡萄酒色泽，提高颜色稳定性的效果。研究发现新鲜红葡萄酒中辅色作用可贡献30%～50%的颜色总量；而在陈酿红葡萄酒中辅色作用也有8%～30%的颜色贡献[4]。另有研究认为，辅色作用进一步形成聚合色素，对陈酿型红葡萄酒的颜色稳定起重要作用[5]。多酚化合物分子中具有可极化的平面结构，并含有富电子的π 系统[5]，可与缺少电子的花色苷烊盐离子结合，使其芳香结构和花色苷烊盐离子结构平面中的发色团呈 “π-π” 堆叠状态，从而起到保护花色苷，防止其与水分子发生亲核加成反应而脱色[4]，是目前研究较多的一类辅色素[6-8]。有研究利用芦丁处理红葡萄酒，发现在波长520 nm 处产生明显的增色效果[9]。而槲皮素作为辅色素与花色苷形成稳定性高的色素复合体，并产生红移变化[10]。Quinn 等[11]认为陈酿过程中橡木桶中酚类物质被浸提到酒中，提高了酒体颜色的稳定性。José 等[12]在葡萄酒酿造过程中添加酚类物质，使得酒体在陈酿过程中的颜色和酒中酚类化合物的稳定性大大提高。

目前关于多酚类辅色素的研究有较多报道，而多数研究仍主要集中在模拟反应环境下的相关指标测定，对于真实红葡萄酒溶液体系下的辅色效应，特别是陈酿过程中对颜色贡献的研究还鲜有报道。本试验拟通过在“赤霞珠”干红葡萄酒陈酿前添加辅色物质——咖啡酸，研究其对干红葡萄酒陈酿过程中颜色的影响，以期为葡萄酒陈酿提供一定的科学依据并产生实践指导作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

试验酒样，中信国安公司2012年生产的“赤霞珠”干红葡萄酒。陈酿用橡木桶为细纹理中度烘烤225 L 二次桶，戴普斯公司。在陈酿前分别以不同质量浓度（100，200，400 mg/L）加入咖啡酸的干红葡萄酒进行橡木桶陈酿，未做添加的橡木桶陈酿样品为对照。

乙醛、亚硫酸、无水乙醇、氯化钠，北京化工厂；酒石酸为分析纯，天津市津科精细化工研究所；乙腈、甲醇、醋酸色谱纯，美国Fisher 公司（Fairlawn，NJ，USA），纯度达98%以上；实验用水，采用Milli-Q（Millipore bedford，MA）纯化水系统制得；咖啡酸（食品级，纯度>95%），陕西慈缘生物科技有限公司；二甲花色素-3-O-葡萄糖苷、非花色苷酚等标准品，美国Sigma-Aldrich 公司；其它药品和试剂（除特殊说明外），美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器及设备

紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；Agilent 1100 HPLC/MSD Trap-VL 仪、Agilent 1200 HPLC-VWD-MS 仪，美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 理化指标分析 酒样常规指标测定方法参照国标GB/T15038-2006 方法[13]。

1.3.2 色度-色调测定 采用CIELAB[14]法，酒样经0.45 μm 水系膜过滤，选择2 mm 光径比色皿，利用紫外-可见分光光度计分别测定波长440，530，600 nm 处的透光率，纯水作为对照，建立CIELAB 坐标系，计算各样品的L*、a*、b*和ΔE*ab值。

1.3.3 辅色化率等的测定 采用Boulton[4]方法测定辅色化（CA%）、游离化（FA%）和聚合化（PA%）花色苷比率：样品pH 值调至3.6，取2 mL 酒样加20 μL 10%乙醛溶液，反应45 min；模拟酒溶液（12%的酒精，5 g/L 酒石酸，0.2 mol/L 氯化钠，pH 3.6） 稀释0.2 mL 酒样20 倍；另取2 mL 酒样，加160 μL 5%SO2反应后，分别测定波长520 nm 下吸光度Aacet、A20、ASO2。样品中各比率计算如下：

1.3.4 花色苷酚的检测 采用Agilent 1100 HPLC/MSD Trap-VL 仪分析样品中的花色苷[15]。样品定性依据本实验室建立的花色苷谱库中质谱、光谱和保留时间信息。定量以二甲花色素-3-O-葡萄糖苷为标准物外标法定量，所有花色苷均以相当于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。

1.3.5 非花色苷的检测 采用Agilent 1200 HPLC-VWD-MS 仪，分析酒样中的非花色苷酚[16]。样品定性依据本实验室建立的非花色苷酚谱库中质谱、光谱和保留时间信息。定量方法采用各非花色苷酚为标准物外标法定量。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）软件进行ANOVA 分析和LSD 多重比较，显著性分析基于P<0.05 显著水平。

2 结果与分析

2.1 基本理化参数分析

陈酿前对试验用“赤霞珠”干红葡萄酒理化指标进行测定。试验用酒在陈酿前各理化指标符合国标GB/T 15038-2006 对干红葡萄酒的要求。

表1 葡萄酒理化指标Table 1 Conventional enological parameters of wine

2.2 陈酿过程中颜色的变化

陈酿过程中颜色变化的CIELAB 参数如表2，酒体L*值随陈酿时间延长逐渐升高，表现为颜色由较深向较浅状态转变。与对照相比，添加咖啡酸组在陈酿过程中可减缓酒体颜色浅化速度，且减缓浅化能力与添加浓度呈正相关。陈酿4 个月时辅色作用明显，添加组的L*值相比于陈酿起始时出现下降趋势，且添加组的L*值是对照组的86%（100 mg/L），85%（200 mg/L），82%（400 mg/L），分析是由于咖啡酸增加了酒中花色苷的辅色化程度而改变酒体的颜色。有研究发现陈酿4～8 个月后，酒体L*值只与酒中的非花色苷酚有关，酚类物质越多酒体亮度越暗[17]。Gao 等[18]也有类似的研究结果，因此陈酿阶段的辅色素对酒体明亮程度起着十分重要的作用。

酒体a*值随着陈酿时间的延长逐渐下降，表现为红色色调减弱，经添加的酒样不仅减缓a*值的下降速度，而且在陈酿4，8 个月时，a*值均高于陈酿起始时。陈酿12 个月时，咖啡酸100，200，400 mg/L 处理样品的a*值分别是对照的123%，130%，133%。瓶储12 个月时，添加组样品对a*值下降的减缓仍有明显作用，且减缓作用均与添加浓度呈正相关。研究发现，不同阶段酚类物质对a*值影响有所不同，陈酿4～8 个月后，游离花色苷对a*值影响变小，只有部分乙酰化的花色苷和几类非花色苷酚与a*值呈显著正相关[17]。

适当的b*值可使酒体颜色更鲜艳饱满[19]。b*值的高低与酒体的黄、蓝色调相关。随着陈酿时间的延长b*值上升，酒体黄色色调加深。咖啡酸处理后的酒样不仅减缓陈酿过程中b*值上升速度，且陈酿4，8 个月时表现出b*值低于陈酿起始时。瓶储12 个月添加组样品对减缓b*值上升仍有明显作用，且减缓作用与添加浓度基本呈正相关。有研究表明，陈酿第8 个月时，咖啡酸与b*值呈极显著负相关，说明咖啡酸含量越多，酒体黄色调越少[17]。

ΔE*ab由样品的L*、a*、b*值计算出表示样品间颜色差异的指标，ΔE*ab＞3 酒样之间的颜色具有肉眼可辨识差异[20]。由表2知，不同时期添加组的全部酒样颜色与对照相比均有肉眼可辨识差别（ΔE*ab=6.13～13.26 a.u.），各时期ΔE*ab值大小与咖啡酸添加浓度呈正相关。

表2 陈酿过程中CIELAB 参数（a.u.，±SD）Table 2 The CIELAB indexes during the aging （a.u.，±SD）

表2 陈酿过程中CIELAB 参数（a.u.，±SD）Table 2 The CIELAB indexes during the aging （a.u.，±SD）

注：CK：对照；C-1：咖啡酸100 mg/L；C-2：咖啡酸200 mg/L；C-3：咖啡酸400 mg/L；T0：木桶陈酿第0 个月；T4：木桶陈酿第4 个月；T8：木桶陈酿第8 个月；T12：木桶陈酿第12 个月；P6：瓶储第6 个月；P12：瓶储第12 个月。样品间的不同字母表示存在有显著性差异（LSD，P＜0.05）。

指标 样品时期T0 T4 T8 T12 P6 P12

2.3 陈酿过程中辅色化率等的变化

酒中花色苷以辅色、聚合、游离形式存在，酚类物质可与花色苷进行辅色作用而使酒体色泽增强[4]，酒中辅色化率随陈酿时间延长逐渐下降。由表3知，添加咖啡处理使酒样的辅色化率下降程度得到缓解，在陈酿初期甚至还出现了提升。José等[21]也有相类似研究结果。陈酿4 个月时辅色化率达到峰值，添加组比陈酿起始时分别增加2%（100 mg/L），11%（200 mg/L），12%（400 mg/L），而对照减少了11%。瓶储12 个月添加组样品辅色化率仍高于对照组（P<0.05）。分析是咖啡酸在陈酿过程中通过脱羧形成乙基或乙烯基酚类化合物，参与酒中部分吡喃型花色苷或更大分子质量花色苷衍生物的生成[22-23]。

聚合色素由酒中游离和辅色化花色苷转变生成，相同条件下比游离花色苷具有更强的抗水化和抗SO2漂白的能力，有较强的颜色稳定性[24]。聚合色素比率在陈酿期间逐渐上升，陈酿起始时4组试样平均聚合色素比率为21%，瓶储12 个月时为68%，说明陈酿过程为酒中聚合色素的产生提供了时间基础。结合陈酿过程中辅色化率变化规律，分析是辅色反应形成较稳定的复合物在陈酿过程中逐渐转变为性质更稳定的聚合色素。

陈酿过程游离花色苷不稳定，因氧化、降解或转化而减少[25]。陈酿起始时，游离色素比率平均为40%，陈酿12 个月时，对照组游离色素比率为28%，添加组分别为15%（100 mg/L），14%（200 mg/L），13%（400 mg/L），添加组的游离色素比率下降比对照更加迅速，且添加浓度与其下降程度呈正相关。瓶储12 个月游离色素比率进一步降低，预测游离色素在之后的贮藏过程中仍持续降低直到消失。

由表3可知，咖啡酸处理可提升酒体在陈酿期间的辅色化水平，分析原因咖啡酸一方面具有抗氧化性，可防止花色苷氧化，也能促进酒中其它酚类物质的稳定，进而更好的保护颜色；另一方面，酚类与花色苷形成π-π 复合物，增加吸光值和最大吸收波长[26]，形成的复合物随陈酿时间推进逐渐转变为性质更稳定的物质[27]，对酒体颜色的稳定做出贡献。

表3 陈酿过程中辅色化率、聚合色素比例、游离花色苷比率的变化 （%，±SD）Table 3 The CA，PA and FA rate of change during the aging （%，±SD）

表3 陈酿过程中辅色化率、聚合色素比例、游离花色苷比率的变化 （%，±SD）Table 3 The CA，PA and FA rate of change during the aging （%，±SD）

注：CK：对照；C-1：咖啡酸100 mg/L；C-2：咖啡酸200 mg/L；C-3：咖啡酸400 mg/L；T0：木桶陈酿第0 个月；T4：木桶陈酿第4 个月；T8：木桶陈酿第8 个月；T12：木桶陈酿第12 个月；P6：瓶储第6 个月；P12：瓶储第12 个月。样品间的不同字母表示存在有显著性差异（LSD，P<0.05）。

指标 样品时期T0 T4 T8 T12 P6 P12

2.4 陈酿过程中花色苷酚的变化

利用HPLC-MS 在陈酿起始时酒样中均检测到4 种单糖苷花色苷，8 种酰化花色苷，7 种吡喃花色苷。陈酿期间酒体的单宁可以与花色苷形成聚合物，进而稳定酒体颜色。此外酒中大量的单体花色苷随陈酿时间的延长逐渐减少直至消失，取而代之的是一些吡喃花色苷和聚合花色苷等[28]，与本试验结果相似。

图1 陈酿过程中酚类物质变化Fig.1 Evolution of phenolic compounds during aging

由图1可知，花色苷总量随陈酿时间延长而逐渐降低，陈酿过程添加组样品的花色苷总量高于对照。陈酿12 个月时比陈酿起始时花色苷含量平均下降56%，添加组分别比对照组高44%（100 mg/L），49%（200 mg/L），56%（400 mg/L），说明添加咖啡酸对陈酿过程中花色苷有保护和稳定作用。游离花色苷在陈酿时会自身降解、聚合、沉淀或与其它物质反应导致其含量下降，这与Alcalde-Eon等[29]的研究结果类似。酰化花色苷变化趋势和单体花色苷相似，瓶储6 个月比陈酿起始时减少87%，之后含量变化幅度逐渐变小。吡喃花色苷含量也逐渐减少，陈酿过程中，咖啡酸能够减缓吡喃花色苷的减少速度，在陈酿后期，处理样品中吡喃花色苷含量要高于对照，分析是由于咖啡酸参与了其合成的缘故。Romero 等[30]发现酒中vitisins 类吡喃花色苷要比其合成前体二甲花翠素有更深的颜色，并且由于花色苷C4 位处的环化作用，使花色苷具有更强的颜色稳定性。

2.5 陈酿过程中非花色苷酚的变化

利用HPLC-MS 从样品中鉴定出黄酮醇类10种，黄烷醇类5 种，羟基苯甲酸类3 种，羟基肉桂酸类2 种。图1表明非花色苷酚类物质总量随陈酿时间的推移呈下降趋势，特别是在瓶储第6 个月时下降迅速，之后变化平缓。

黄酮醇总量随陈酿时间延长逐渐下降，陈酿12 个月时比陈酿起始时，对照减少71%，而咖啡酸处理减少了63%（100 mg/L），59%（200 mg/L），58%（400 mg/L），减少的比率随添加浓度的增加而降低。黄烷醇总量随陈酿时间延长逐渐下降，陈酿12 个月时与陈酿起始时相比，对照减少66%，而咖啡酸处理减少57%（100 mg/L），53%（200 mg/L），50%（400 mg/L），瓶储6 个月各组酒样中黄烷醇类物质含量下降剧烈，减少的比率随添加浓度的增加而降低，酒中其它物质，如乙醛、糠醛也可参与黄烷醇的聚合反应使其含量降低[31]。酚酸类物质变化规律符合非花色苷酚类物质总体规律（考虑到添加处理影响有关物质的含量，这里将样品中的咖啡酸含量去除进行分析讨论），陈酿起始时酚酸类含量较高，瓶储第6 个月各组酒样中酚酸类物质含量下降剧烈，平均比陈酿起始时减少了89%。

3 结论

试验选择橡木辅色素咖啡酸作为辅色物质，在葡萄酒陈酿前进行添加，通过观察木桶陈酿和瓶储过程中红葡萄酒CIELAB 参数、辅色化率及酚类物质变化情况，以研究其对干红葡萄酒颜色品质及其多酚的影响。试验发现，陈酿前添加咖啡酸，将有效延缓红葡萄酒在陈酿过程中颜色亮度（L*）的升高和红色色调（a*）的下降，增大与对照酒样的颜色差异（△E*ab），其产生效果与添加咖啡酸浓度呈正相关。另外，添加咖啡酸处理可延缓陈酿阶段红葡萄酒中花色苷辅色化程度的降低，促进酒中聚合花色苷比率的升高，并有助于葡萄酒中单体、酰化、吡喃型花色苷含量的维持和稳定，同时对黄酮醇、黄烷醇、酚酸这类非花色苷酚含量的下降也有延缓作用。