发酵乳杆菌CECT5716计数方法比较

曹春杰，王淑晨，赵紫芙，于景华，田慧青，陈铁涛

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.百施(上海)生物科技有限公司，上海200235）

0 引 言

母乳是婴儿肠道乳酸菌的重要来源[1]，而发酵乳杆菌CECT5716 是一株分离自健康母乳的益生菌株，能够显著降低胃肠道感染发病率并且在婴儿早期服用具有良好的耐受性[2]及长期安全性[3]。目前在国外已经有了一些关于发酵乳杆菌CECT5716 应用于婴幼儿配方奶的研究[4-5]。发酵乳杆菌CECT5716 在母婴配方奶粉中有很大的应用意义及前景，但是乳酸菌在冻干或喷雾干燥制备过程中极易受到损害；另外，菌粉制备后其水分含量、储存温度、长时间的运输过程也会对菌体自身活力产生影响[7]。

目前该进口菌粉产品在应用过程中通过国标（GB4789.35-2016）无法检测到与产品说明（外标法检测得）中相同的菌数。该研究旨在通过对比中外标准检测过程的差异性设计实验找出问题所在并提出可行性改进意见。

1 实 验

1.1 材料及器皿

发酵乳杆菌CECT5716 固体菌粉，MRS 合成培养基，MRS 进口培养基，7.5L 厌氧盒，厌氧产气袋，厌氧指示剂，90 mm 塑料培养皿。

1.2 仪器与设备

超净工作台，高压灭菌锅，微型旋涡混合仪，电子天平，pH 计，恒温水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 乳杆菌计数

以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 溶解介质的无菌均质杯内，于转速8 000 ～10 000 r/min均质1 min，制成1∶10 样品匀液，根据待检样品活菌总数的估计，选择3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1 mL 样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48 ℃的MRS 琼脂培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使混合均匀。36±1℃厌氧培养72±2h[7]。

表1 为中外乳杆菌技术方法的差异，实验变量将参照该表进行设计。

1.3.2 数据分析

表1 中外标准差异

用IBM SPSS 软件进行数据显著性分析，显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 探讨制样前解冻对检测结果的影响

将固体菌粉（-20 ℃保存）分为两组，一组置于4 ℃下解冻6 h，另外一组继续置于-20 ℃进行保存，待6 h 后，将两组同时取出，参照国标（GB4789.35-2016）操作进行培养。表2 为不同解冻情况对应的计数结果。

表2 不同解冻情况对应的计数结果 1011g-1

由表2 可知，在4 ℃下解冻6 h 后，菌落数相较不进行解冻操作组均有不同幅度的提升，从平均值看解冻后检测到的菌落数略有增加，说明解冻操作对于冷冻保藏下的固体菌种检测具有积极意义。

2.2 不同处理方式对检测结果的影响

参照1.3.1 中乳酸菌计数方法，按照表3 中实验处理方式进行培养并记录结果。

表3 针对样品采用不同的处理方式进行培养

通过对比中外标准中处理方式的差异，设计如下表格探讨溶解介质、溶解温度、复溶情况、均质方式和接种方式对检测结果的影响。表4 为不同计数方法得到检测结果。

由表4经统计学分析后得到以下结果：

（1）混匀方式对计数结果的影响。将计数方法1与2，方法3 与4，方法5 与6，方法7 与8 两两进行独立样本T 检验，结果显示无显著性差异（P＞0.05），说明用国标法中“均质杯+吹吸”与外标法中“摇动+漩涡混合器”两种均质方式对检测结果无明显影响，不是造成中外标准检测结果差异的主要原因。

表4 不同处理方式计算结果 1011g-1

（2）溶解温度对计数结果的影响。对计数方法1与3，方法2 与4 两两进行独立样本T 检验，结果显示无显著性差异（P＞0.05），表明室温与37 ℃条件下溶解固体菌粉对检测结果的影响不显著，溶解温度不是造成中外标准检测结果差异的主要因素。

（3）溶解介质对计数结果的影响。对计数方法5与7，方法6 与8 两两进行数据分析，从平均值看使用蛋白胨水复溶后菌落数有所增加，但是独立样本T 检验结果显示无显著性差异（P＞0.05），表明溶解介质为1%缓冲蛋白胨时更有利于恢复固体菌粉的活力，是构成中外检测标准差异的因素之一，但是其效果在统计学上分析不显著。

（4）复溶情况对计数结果的影响。对计数方法3与5，方法4与6两两数据分析，从平均值看复溶45 min后检测所得菌落数会有所增加，但是不构成显著性（P＞0.05），说明复溶45 min 后有助于固体菌粉恢复活力，是中外标准差异的因素之一，但统计学分析不显著。

2.3 不同培养基对检测结果的影响

将固体菌粉参照国标（GB4789.35-2016）进行同样的处理后分别放至国标法自配MRS 培养基、外标法中进口MRS 培养基、市售国标法合成MRS 培养基和在国标法自配MRS 培养基中加入适量维生素以及复合加入维生素与肝浸汁的物种不同培养基中相同条件下培养后计数。表5 为不同培养基上的计数结果；图1为5种培养基菌落数的平均值。

表5 不同培养基上的计数结果 1011g-1

图1 不同培养基培养下的菌落数平均值

由图1 可以看出，在国标法自配的MRS 培养基中加入维生素和肝浸汁后菌落数有明显的升高，进口MRS 培养基与国标法自配培养基相比，培养后菌落数略有升高。对表5 中不同培养基成分培养的检测结果进行ANOVA 分析，结果表明国标法合成MRS 培养基与外标法进口MRS 培养基培养的菌落数差异不显著（P＞0.05）。在国标法培养基中加入维生素和肝浸汁后，菌落数相比国标法自配培养基和外标法进口MRS培养基有显著性增加（P=0.012及P=0.032）。

3 结果与讨论

本研究针对中外标准检测发酵乳杆菌固体菌粉过程差异造成检测结果性差异的现象设计相关实验，从固体菌粉有无解冻，检测中处理方式的不同以及培养基的差异3 个角度入手，并结合数据分析探究检测结果差异产生的原因。

结果显示冷冻保存（-20 ℃）的固体菌粉在4 ℃条件下进行解冻6 h 会使检测结果中菌落数量增加，但是最佳效果对应的具体解冻时长需要再进一步进行研究；在探究处理方式对检测结果的影响实验中，国标法中“均质杯+吹吸”与外标法中“摇动+漩涡混合器”两种均质方式检测到的菌落数没有明显差异，说明两种标准中均质条件不是构成结果差异的主要因素；在溶解过程中，室温条件与37 ℃条件相比差异不明显，不是构成结果差异的主要因素；溶解后用1%缓冲蛋白胨水在37 ℃下复溶45 min 后菌落数有所提升，说明在此条件下进行复溶更有利于固体菌粉恢复原活力，减小中外检测结果的差异。该结论与文献[6]相符，但在日常应用中复溶时间需要进一步验证以得到最佳效果。在探究培养基对菌落数的影响实验中，发现相同条件下在外标法所用培养基与国标法自配培养基中培养后，检测结果差异并不显著，说明中外培养基不是检测过程中差异的主要来源。此外，在国标法培养基中加入的不同营养物质探究其影响，结果显示加入混合维生素后检测结果中菌落数相较两种标准中培养基均有升高，但是差异不具有显著性，而同时加入混合维生素和肝浸汁后菌落数显著增加，说明混合维生素与肝浸汁的共同加入更有利于刺激发酵乳杆菌的生长，提高检测结果的准确性。

为了更准确计算发酵乳杆菌CECT5716 固体制剂的具体含量，建议：（1）经长时间冷冻保存后的固体菌粉在进行检测前要进行解冻操作以提高菌体的活力；（2）用1%缓冲蛋白胨水进行溶解操作后在与培养条件相同的温度下进行复溶操作能够进一步提高菌体的活力，使有活力的菌数更贴近原始值。此外，在培养基中加入适量的营养物质能够为菌落生长提供更多的营养物质，刺激菌体生长便于观察。