线粒体功能障碍导致白癜风的机制: 基于生物信息学方法

张佳林, 陈逴凡, 徐英萍, 史晓蔚, 王天晶, 任盈盈, 罗光浦

南方医科大学皮肤病医院,广东 广州 510091

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病,临床表现为皮肤、黏膜等部位黑色素细胞的选择性丢失致皮肤、粘膜失去颜色,变成白斑,世界范围内发病率为0.1%～2%[1]。其发病机制尚不明确,可能与免疫功能紊乱、氧化应激损伤、黑色素细胞功能异常、线粒体结构和功能损伤、miRNA异常表达等相关,治疗及预防复发较困难[2]。目前白癜风的治疗仍以局部/系统使用免疫抑制剂和光疗为主。而随着对其发病机制研究的不断深入,外用或口服JAK抑制剂开始应用于治疗白癜风,但疗效不一,因此尚未能成为治疗的首选药物[3]。

线粒体功能障碍被认为是白癜风失去氧化还原稳态(高自发活性氧产生和缺乏抗氧化网络)的关键。黑色素细胞和CD8+T细胞中功能失调的线粒体对于诱导黑色素细胞凋亡具有重要意义。研究证明氧化应激在减少线粒体产生ATP的同时,可显著抑制黑色素细胞的迁移能力,说明黑色素细胞的迁移与线粒体功能息息相关[4]。线粒体功能障碍会导致细胞内氧自由基的堆积,可能会导致白癜风患者黑素细胞发生凋亡或坏死,致使白癜风发病[2]。线粒体—黑素细胞的相互作用可能是白癜风发病机制中的重要环节。因此,从分子层面寻找线粒体功能障碍导致白癜风的机制具有现实意义。本研究基于生物信息学方法,探讨线粒体功能障碍导致白癜风的机制研究。

1 材料与方法

1.1 获取白癜风—线粒体功能障碍基因集

从以下开源数据库获取白癜风相关的靶基因:CTD(http://ctdbase.org/),GeneCards(https://www.genecards.org/),OMIM数据库(http://www.omim.org), NCBI Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),取并集。截止至2022年7月1日,MITOMAP人类线粒体基因组数据库收录了56 910份人类线粒体的全长序列数据和接近1.9万个变异基因位点,且列举了可能有致病性的变异位点相关的临床表型,是线粒体疾病测序最常用的数据库之一。本研究从MITOMAP数据库(https://mitomap.org/MITOMAP)下载线粒体功能障碍的相关基因。使用维恩图工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)和Microsoft Excel进一步获得白癜风与线粒体功能障碍之间的交集基因。

1.2 构建蛋白质—蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络

PPI网络有助于更好地了解靶基因在蛋白质水平上涉及的生物学机制,使用STRING 11.5数据库(https://cn.string-db.org/)构建PPI网络,物种设置为“Human”,置信度评分设置为>0.4[5]。使用Cytoscape 3.9.1软件(https://cytoscape.org/) 对PPI网络进行分析和可视化,使用Cytoscape软件的网络分析器插件cytoHubba计算靶点度值 (degree),degree排列前10 的作为核心基因。

1.3 交集基因的GO和通路富集分析

为了解白癜风和线粒体功能障碍中共同基因的功能特征,通过g:Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)对交集基因进行GO富集分析,物种设置为“Human”,adjustP<0.05的GO条目被认为具有显著性的富集意义;采用Metascape数据库(http://www.metascape.org/)对交集基因进行通路富集分析,参数设置为“H species”。

1.4 TF-基因和miRNA-基因调控网络的构建

TF是可以与特定DNA序列结合并调节基因表达的蛋白质,介导mRNA降解或翻译抑制的miRNA是一类内源性短非编码RNA。采用NetworkAnalyst 3.0(https://www.networkanalyst.ca/)对核心基因构建TF-基因和miRNA-基因调控网络,并使用Cytoscape 3.9.1软件对调控网络进行可视化。

1.5 候选药物的预测

使用Toppgene数据库(https://toppgene.cchmc.org/help/help.jsp)预测靶向核心基因的潜在药物。Toppgene数据库的药物数据来源于DrugBank、STITCH、 CTD和Broad Institute CMAP Down 4个数据库。候选药物按照P从小到大排序,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白癜风—线粒体功能障碍数据集

分别从CTD/OMIM/GeneCards/NCBI Gene数据库收集到了9 995、30、1 252、242个白癜风靶基因,通过合并和去除重复项后得到10 606个白癜风靶基因(图1A)。从MITOMAP数据库下载参与线粒体疾病中的结构核基因及非结构核基因,总共159个相关基因,其中12个基因收录了别称。通过在两组基因中取交集,获得90个白癜风—线粒体功能障碍的交集基因(图1B)。

图1 白癜风与线粒体功能障碍共同基因的筛选 1A:白癜风的相关基因并集图;1B:白癜风基因与线粒体功能障碍基因的韦恩图

2.2 PPI网络构建

将90个共同基因导入STRING数据库构建PPI网络,并使用 Cytoscape进行可视化处理,PPI网络由90个节点和1 027条边缘组成(图2)。使用cytoHubba插件列出degree值排前10的核心基因,共13个核心基因(其中4个基因并列第10),分别为COX10、NDUFS3、NDUFA9、SURF1、NDUFV1、BCS1L、NDUFS1、NDUFS8、COX15、NDUFS7、NDUFS4、NDUFS2和LRPPRC。

图2 蛋白质—蛋白质互作网络图(红色的节点代表核心基因,淡黄色的节点代表非核心的共同基因,线代表互相作用的关系)

2.3 基因本体和通路富集分析

以GO数据库为注释源,分为三类富集条目,包括生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cellular components,CC)和分子功能(molecular function,MF)。结果显示BP主要富集在线粒体呼吸链复合体组装等; CC主要富集在线粒体;MF主要富集在为氧化还原驱动的跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶活性等(图3)。通过Metascape数据库得到通路富集结果(图4),其中富集度较高的通路包括呼吸电子传输、线粒体tRNA氨基化、细胞色素复合物组装、线粒体复合体Ⅳ组装、泛醌生物合成过程、线粒体翻译的调节、呼吸链复合体Ⅰ(中间Ⅴ/380kD和Ⅵ/480kD),活性氧物种代谢过程等。

图3 GO功能富集分析结果图

图4 KEGG富集分析结果图

2.4 TF-基因和miRNA-基因调控网络

TF-基因相互作用网络由 82个节点和99条边组成,呈现了5个核心基因和TF的相互作用(图5A)。其中,SURF1受40个TF调控,LRPPRC受19个TF调控,NDUFS1受21个TF调控,NDUFS4受12个TF调控,NDUFA9受7个TF调控。TF-基因相互作用网络中转录因子ATF1、KDM5A的度值均为4。KDM5B、PHF8、SAP30的度值均为3。miRNA-基因调控网络包括77个节点和75条边,由4个基因和73个miRNA组成(图5B)。其中,hsa-mir-1-3p、hsa-mir-16-5p的度值均为2。

图5 TF-基因和miRNA-基因的调控网络(红色的节点代表基因,蓝色的节点代表TF或miRNA) 5A:TF-基因互作图;5B:miRNA-基因互作图

2.5 候选药物的预测

预测药物根据P值取排名前20的药物(表1),结果表明thiamine triphosphate(三磷酸硫胺)、Benit(贝尼特)、Isoniazid(异烟肼)、acetoacetate(乙酸乙酯)、thiamine pyrophosphate(焦磷酸硫胺)、Bioquinon(生物醌)、beta-hydroxybutyrate(β-羟基丁酸)、lipoic acid(硫辛酸)、Phosphoryl(磷酰)、pyruvic acid(丙酮酸)、ubiquinols(还原型辅酶Q10)、lactate(乳酸)、NADH、riboflavin 5’-phosphate(核黄素5’-磷酸)、AC1L1AN5、AC1L3O4T、phencarol(苯酚)、PQQ Cofactor(PQQ辅因子)、Dexon、reduced diphosphopyridine nucleotide(还原二磷吡啶核苷酸)可能是治疗白癜风的药物。

表1 靶向核心基因的预测药物

3 讨论

研究表明,线粒体功能障碍可能是导致细胞氧化应激损伤的原因之一,在白癜风的发病中起重要作用[2]。本研究通过生物信息学技术得到90个白癜风和线粒体功能障碍的相关基因。为保留表达更多的基因信息,本研究将90个共同基因进行GO富集分析,结果提示线粒体呼吸链复合体组装是白癜风和线粒体功能障碍共同参与的关键生理过程,KEGG富集分析提示呼吸电子传输是重要的分子作用通路,线粒体呼吸链在其中起关键作用。线粒体呼吸链由4个多蛋白的复合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)及泛醌(辅酶Q)和细胞色素C等组成,其氧化磷酸化过程为机体提供95%以上的能量供应,同时消耗大量的氧气。呼吸链中ROS的产生最主要部位是复合物Ⅰ和复合物Ⅲ,且贯穿呼吸运动的整个过程[6]。既往研究表明,在病理状态下细胞呼吸频率增加时,呼吸链效率降低,进而使细胞色素含量降低,影响细胞呼吸的适应性,使其更容易氧化过激,使细胞内ROS增多[7]。蓄积的大量ROS会对线粒体DNA、呼吸链复合酶和脂质等造成损伤[8],进一步影响线粒体的功能,产生更多的ROS,形成恶性循环。ROS的过度蓄积可以导致细胞膜过氧化,线粒体膜电位降低导致白癜风表皮中黑素细胞及角质形成细胞发生空泡化及凋亡[9],促使白癜风的进展。此外,氧化应激可致黑素细胞的迁移能力减弱,使白癜风的复色难度增加。

本研究得到白癜风和线粒体功能障碍的13个核心基因,并预测出其相互作用的TF与miRNA,其中NDUFA9、SURF1、NDUFS1、NDUFS4和LRPPRC也是预测出的排名前列药物的靶点,提示上述5个基因在白癜风发病中的关键作用。NDUFA9的突变可影响线粒体复合物Ⅰ的组装[10];SURF1编码的蛋白对维持人线粒体电子呼吸链中细胞色素C氧化酶(COX)的抗氧化剂稳定性具有重要作用[11];NDUFS1的突变可导致其所编码的呼吸链蛋白复合物Ⅰ的稳定性降低,并破坏复合物Ⅰ中两个铁硫簇之间的电子转移[12];LRPPRC编码蛋白的缺失不仅会降低线粒体mRNA的稳定性,还会导致mRNA多腺苷酸化的丧失和线粒体翻译异常的出现[13];NDUFS4为线粒体疾病明确的致病基因,NDUFS4突变可导致NDUFS4蛋白缺乏,致使线粒体内膜上的铁硫蛋白变形,影响复合物Ⅰ的装配和激活,降低复合物Ⅰ的稳定性[14-15]。NDUFS4的表达缺失可导致线粒体的形态异常及活性氧水平增加,影响线粒体功能[16]。因此,5个关键基因在线粒体发挥正常功能中均起到关键作用。研究表明,线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的含量下降,使ROS产生增加,破坏了黑素细胞核DNA,导致大量促炎因子及抗黑色素合成细胞因子释放,刺激机体发生自身免疫反应,参与白癜风的发生[17]。但这5个基因与白癜风目前尚无直接研究,未来可成为白癜风发病机制研究的新方向。

本研究构建了miRNA-基因调控网络图,结果提示hsa-mir-1-3p、hsa-mir-493-3p、hsa-mir-16-5p等可能发挥重要作用。miR-1是一种单链非编码RNA,作为微调因子在凋亡过程的调节中起着重要作用。miR-1表达的缺乏可通过线粒体细胞凋亡途径,影响神经嵴和颅面骨骼的发育,导致黑色素细胞发育缺陷[18]。Mansuri等[19]通过测定白癜风患者和对照组全血miRNA表达谱分析,表明miR-1可能作为白癜风的潜在生物标志物。而作为节段型白癜风患者的候选生物标志物,miR-493-3p在循环外泌体和皮损周围皮肤中的表达增加,导致角质形成细胞中多巴胺的分泌增加,ROS和黑色素细胞凋亡显著增加,可能是节段型白癜风发病机制中的重要环节[20]。此外, miR-493过表达可导致AKT2蛋白表达减少,影响PI3激酶-AKT通路中涉及的蛋白质合成,导致线粒体电位丧失和细胞色素C释放,促使细胞凋亡[21]。miR-1、miR-493均在白癜风和线粒体功能障碍的发病中至关重要,可能是今后研究的重要方向或药物潜在靶点。

转录因子是可以与特定DNA序列结合并调节基因表达的蛋白质,对保证目的基因表达的强度、时间性和空间性有重要作用。本研究构建的TF-基因调控网络图发现ATF1、KDM5A、KDM5B等转录因子度值较高。其中ATF1可能通过对NADPH氧化酶中催化亚基NOX1的诱导,影响线粒体呼吸链,导致细胞内ROS的增加[22]。KDM5A、KDM5B均属于组蛋白去甲基化酶,是KDM5 4种亚型中的2种,参与表观遗传调控过程。实验证明KDM5B可能通过调节SIRT3,影响线粒体葡萄糖和脂质的代谢,导致线粒体代谢功能障碍和ROS过度产生促进[23]。因此ATF1、KDM5可能是白癜风治疗的潜在靶点。

本研究预测得到三磷酸硫胺素、Benit、异烟肼、乙酰乙酸盐、焦磷酸硫胺盐、生物醌、β-羟基丁酸酯、硫辛酸、磷酸、丙酮酸、辅酶Q10等为白癜风治疗的候选药物,其中硫辛酸、辅酶Q10均是抗氧化剂。有研究在白癜风患者接受窄谱紫外线(NB-UVB)治疗期间,加用含有α-硫辛酸的抗氧化剂,发现患者的过氧化氢酶活性和活性氧生成量明显降低,且治疗成功率提高,说明联合口服含有α-硫辛酸的抗氧化剂可显著提高NB-UVB的临床有效性,减少氧化应激[24]。临床观察发现,口服硫辛酸联合倍他米松注射液和NB-UVB治疗进展期的非节段型白癜风安全有效,推测硫辛酸可以加速色素沉着的初始反应[25-26]。Passi 等[27]证明在白癜风患者中,辅酶Q10的含量明显下降。辅酶Q10除了在线粒体中作为电子和质子载体的功能外,还以其还原形式作为一种强大的抗氧化剂,阻止生物膜中脂质过氧化反应,是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。目前辅酶Q10作为口服抗氧化的药物,尚未有随机对照研究证实其治疗白癜风的有效性,今后可能成为新的白癜风治疗药物。

综上所述,本研究通过生物信息学方法筛选得到90个白癜风和线粒体功能障碍的共同致病基因,主要参与的关键生理过程是呼吸链复合体组装,分子作用通路是呼吸电子传输,同时还得到miR-1等相关的miRNA和ATF1、KDM5等相关的TF,预测硫辛酸、辅酶Q10等为白癜风治疗的候选药物,较完整地分析了线粒体功能障碍在白癜风发病中的可能作用,发掘了潜在的治疗靶点,为白癜风发病机制的阐明和药物治疗提供新的视角。但本研究数据均来源于网络数据库信息,仍需完善相关试验进一步验证。