离子交换萃取-反相色谱法测定婴幼儿配方乳粉和保健食品中叶酸

宋戈,王鑫

（1.黑龙江省华测检测技术有限公司，哈尔滨150028；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028）

0 引 言

叶酸( folic acid) 又称维生素B9，是一种重要的B族维生素，是维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能不可缺少的一类有机化合物，在人体生长代谢、发育过程中发挥着重要的作用，是婴幼儿配方奶粉中的基本营养成分。同时由于人体不能自身合成叶酸,只有从膳食中摄取[1],所以叶酸会在保健食品或者营养补充品中添加。目前检测叶酸的方法有很多,微生物法是应用最为广泛的, 也是美国官方分析化学家协会的推荐方法。现行的国家标准GB5009.211-2014《食品中叶酸的测定》[2]采用的也是微生物法。微生物法灵敏度高、结果准确，但周期长、步骤繁琐、重复性差，影响因素多。随着技术的发展，出现以微生物理论为基础的酶联免疫法[3]、试剂盒法（96 微孔板法）[4]，虽然耗时缩短，操作简便，但精密性和稳定性仍然较差。与此同时国内外文献报道利用仪器检测叶酸的方法也很多，如电化学法[5-11]、超高效液相色谱串联质谱法[12-17]、超高效液相色谱串联离子色谱法[18]等，灵敏度高但须要特殊的配备，不适合日常检测；还有荧光法[19-21]和紫外法[22-26]，但需要进行衍生反应或不适用于基质复杂的婴幼儿配方奶粉和保健食品中叶酸的提取与测定。

本研究尝试采用不同溶剂对婴幼儿配方乳粉和保健食品样品进行提取，配以不同的固相萃取方式进行净化富集，加以优化并比较除杂效果、重复性、准确性以及灵敏度，建立操作方便准确性好的固相萃取-高效液相色谱法，为婴幼儿配方乳粉和保健食品中叶酸的日常检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-20AD 高效液相色谱仪，日本岛津公司；SPD-20AV 紫外检测器,日本岛津公司；TTL-DCⅡ水浴加热氮吹仪,北京同泰联科技发展有限公司；pB-10酸度计，德国Sartorius 公司；KQ-250DE 超声波振荡器，昆山市超声仪器有限公司；VORTEX3 涡旋混合器，德国IKA 公司；SQP天平，德国Sartorius公司。

1.2 材料与试剂

叶酸(≥99%)，德国Dr.Ehretorfer 公司；二水合磷酸二氢钾(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸（色谱纯）、氢氧化钠、氨水（质量分数约25%）、碳酸钠、L-抗坏血酸和二水合乙二胺四乙酸二钠，天津科密欧公司；WatersOasis MAX 固相萃取柱6cc/150mg，美国Waters 公司，实验用水均为蒸馏水，以上试剂除标注的外均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液

叶酸标准储备液：准确称取叶酸对照品12.5 mg左右，用0.1 mol/L Na2CO3溶液溶解，加入250 mg 抗坏血酸并用水定容至50 mL 棕色容量瓶中，配制成250 mg/L 的标准储备液。4 ℃避光保存，有效期为2个月。

叶酸标准工作液：准确量取1.0 mL 叶酸标准储备液，用水定容至50 mL 容量瓶中，稀释成5.0 mg/L 的标准工作溶液，现配现用。

1.3.2 样品处理

称取婴幼儿配方乳粉、保健品等固体样品约2.0 g于50 mL 离心管中，加入10 mL (50±5 ℃）的水将试样充分振荡溶解；液体样品约10.0g 于50 mL 离心管中。加入5.0mL，0.1 mol/L EDTA 溶液充分混合后，再加入10 mL，0.1 mol/L Na2CO3（含5 mg/mL 的L-抗坏血酸）溶液进行混匀后超声波振荡15 min，加入15 mL 乙腈漩涡振荡1 min，用水转移定容至50 mL。摇匀滤纸过滤后取滤液10 mL,上样到用甲醇和水活化过的WatersOasis MAX 固相萃取柱（6 cc/150 mg）中，分别用6 mL 水和甲醇淋洗，再用6 mL 5%甲酸甲醇溶液洗脱至氮吹管中，于50 ℃下浓缩近干，加入1 mL 0.002 mol/L Na2CO3（含0.1 mg/mL 的L-抗坏血酸），振荡超声溶解后过0.45 um 水膜上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Inertsustain AQ-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：25 ℃；检测器：紫外检测器，检测波长：280 nm；流动相：甲醇+0.05 mol/L 磷酸二氢钾（pH 为4.5）=30+70，流速：1.0 mL/min。叶酸标准溶液的色谱见图1。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择与优化

图1 叶酸标准溶液色谱

由于叶酸在碱性条件下易溶且稳定性好，称取固体样品用10 mL 水溶解或液体样品后，分别采用0.05 mol/L 磷酸盐溶液[2]（pH6.8）、0.01 mol/L 氢氧化钠[2]、0.1%氢氧化钠[2，22]、0.5%氨水溶液[13，24]、0.01 mol/L 碳酸钠溶液[14], 0.1 mol/L 碳酸钠溶液[25-26]提取。为了防止叶酸氧化损失，每种提取剂都含有5 mg/mL 的L-抗坏血酸。经过振荡、超声提取后进行pH 值测定，只有用0.1 mol/L 碳酸钠溶液提取的溶液呈碱性。由于婴幼儿配方乳粉和保健食品样品体系呈酸性，而且具有一定的缓冲性，加入的提取剂的碱性弱，无法中和样品自身的酸性，会导致叶酸提取不完全和损失。此外叶酸在酸性条件下不稳定，易氧化损失，为保证在整个处理过程包括进一步固相萃取处理的碱性基质环境，应采用碱性强的提取剂，所以选择0.1 mol/L 碳酸钠，比氢氧化钠缓冲性强，稳定且存放时间长，也避免了氨水的刺激性气味和易挥发的缺点。

2.2 固相萃取的选择

叶酸具有谷氨酸结构[27]，样品经碱性溶剂提取后，在提取液中叶酸呈弱阴离子态，提取液进一步处理上样净化前仍呈碱性，则可以采用混合阴离子交换固相萃取柱净化富集；若提取液经过处理上样净化前变成酸性，叶酸在溶液中呈分子态，具有蝶啶环和苯环，可以采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱净化富集。由于样品溶液加入提取剂提取后无法得到澄清的滤液，结合日常实验沉淀蛋白除杂的方法，选取了加入甲醇、乙醇、乙腈、亚铁氰化钾与乙酸锌、高氯酸和调pH 值处理。其中亚铁氰化钾与乙酸锌结合沉淀处理得到了澄清的滤液，但无论采用混合阴离子交换固相萃取柱（MAX）还是采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱(HLB)进行净化富集后测定，检测结果和回收率均偏低近三分之一。因为乙酸锌和亚铁氰化钾混合使用会形成白色的络合物, 此络合物会与部分叶酸结合, 使部分叶酸损失, 造成结果不准确[20]。用甲醇、乙醇、乙腈沉淀蛋白质除杂时，即使在提取溶液中加入比例到达50%, 仍难以过滤。当提取液中加入5 mL 0.1 mol/L 的EDTA 溶液，不仅可以螯合金属元素，有利于叶酸的提取[25]，同时加入乙腈的比例达到30%沉淀效果较好，固相萃取净化时不会导致被测物流失，而改用甲醇和乙醇时，即使加入的比例达到50%沉淀效果仍较差。0.1 mol/L EDTA 溶液加入的量过少，则加大乙腈的量才会有较好的沉淀效果，当净化液中乙腈比例过大，无论用MAX 固相萃取柱还是用HLB 固相萃取柱净化，都会导致被测物流失；0.1 mol/L EDTA 溶液加入的量过多，即使加大乙腈的量也会导致沉淀效果较差。提取液加入EDTA 溶液和乙腈，混匀超声振荡后过滤得到滤液呈碱性，于是按1.3.2 进行净化处理,上机测定的色谱见图2。

另外提取液经过加高氯酸和调pH 值处理后都能得到澄清的滤液，加高氯酸和调pH 值沉淀蛋白的原理一样，但加高氯酸简单直接。提取液经过加高氯酸处理得到的滤液呈酸性，则取10 mL 滤液上样到用甲醇和水活化过的WatersOasis HLB 固相萃取柱（6cc/150 mg）中，用6 mL 水淋洗，再用6 mL 甲醇洗脱至氮吹管中，于50 ℃下浓缩近干，加入1 mL 0.002 mol/L Na2CO3（含0.1 mg/mL 的L-抗坏血酸），振荡超声溶解后过0.45 um 水膜上机测定，色谱见图3。

通过比较谱图2 和3，可以看出样品经过MAX 固相萃取柱净化处理后测定，杂质干扰少，分离度好。另外样品经过HLB 固相萃取柱净化处理须要将提取液加高氯酸处理使滤液呈酸性，会导致叶酸不稳定。通过试验证明样品经过HLB 固相萃取柱净化处理的测定结果重复性较差，回收率较低，故最终采用1.3.2处理方式。

图2 样品经混合阴离子交换固相萃取的色谱

图3 样品经聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取的色谱

2.3 色谱条件的确定

查阅文献,分离测定叶酸采用的流动相为0.05 mol/L或0.1 mol/L 的磷酸盐溶液和甲醇体系，色谱柱为常规键合C18 柱[20-25]。结合实验室条件，选用了Inertsus⁃tain AQ-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。虽然高浓度的缓冲液做流动相可以改善峰形和提高灵敏度，但对色谱系统会带来堵塞和损伤的风险，在被测物的峰形和灵敏度有保障的前提下，选用0.05 mol/L的磷酸盐溶液。而甲醇比乙腈兼溶盐的能力强，在叶酸的检测波长280 nm 下没有背景吸收，宜选作做流动相的组分。实验证明叶酸在C18 色谱柱中的保留性与磷酸盐溶液的pH 值和流动相中甲醇的比例有关，由于叶酸易溶于碱性溶液，磷酸盐溶液的pH 值越大时，叶酸在色谱柱中呈离子态，流动相对叶酸洗脱能力越强，叶酸的保留时间越短，会导致杂质干扰和分离度下降；而磷酸盐溶液的pH 值变小时，叶酸在色谱柱中呈分子态，流动相对叶酸洗脱能力变弱，叶酸的保留时间变长，灵敏度会下降。磷酸盐溶液pH 值不变时，流动相中甲醇的比例越大，叶酸的保留时间越短，在保障被测物分离度的前提下，应选择提高灵敏度的流动相组分和配比。通过对比不同pH 值磷酸盐溶液和不同甲醇比例的流动相对样品中叶酸测定的分离度和灵敏度，采用0.05 mol/L 磷酸盐溶液（pH4.5）和甲醇比例为70∶30 混合的流动相较为合适，测定标准溶液和样品的色谱见图1和2.

2.4 标准曲线和检出限

取不同浓度叶酸标准溶液0.2、0.5、1.0、5.0、50、250 mg/L 注入HPLC，记录目标峰峰面积。以峰面积与标准溶液浓度绘制线性回归曲线，其线性关系为:y=11.817x-1.411，相关系数R2=0.9998,线性范围0.2～250 mg/L，并以3 倍信噪比计算出固体样品称取2 g 的检出限为0.5 mg/kg，液体样品称取10 g 的检出限为0.1 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

以同一个婴幼儿配方乳粉为实验材料，称取样品平行测定8 次，再称取样品分别加入0.5 mL 和1 mL 5 mg/L 的叶酸标准溶液,进行8 次平行测定，计算回收率以及样品测定值与回收率的相对标准偏差(RSD)。回收率在91.2～103.5%，回收率的RSD 在2.99%～7.56%，样品测定值的RSD 在2.59%～6.96%。由此可以看出，测定结果的较为稳定，方法的重复性较好，准确性好。

2.6 实际样品的测定

按照本方法对市售的婴幼儿配方乳粉、复合维生素片、叶酸片样品进行叶酸含量的测定，结果见表1。从实际样品的检测结果来看，该方法的灵敏度和准确度可以满足实际测试的需求。

表1 样品中叶酸的含量

3 结 论

本文重点探讨了碱性溶剂对婴幼儿配方乳粉和保健食品样品中叶酸进行提取，采用EDTA 溶液配合乙腈进行沉淀除杂，比较不同的固相萃取方式的除杂效果、分离度以及灵敏度，确定以混合阴离子交换固相萃取的方式净化富集，用0.05 mol/L 磷酸盐溶液（pH4.5）-甲醇（7+3）做流动相，键合C18 色谱柱分离测定，结果重复性好，准确度高，适合婴幼儿配方乳粉和保健食品中叶酸含量的生产监测和日常监管检测。